[发明专利]一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应用

摘要

本发明涉及一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应用，该方法利用在Loxl3基因关键外显子两端添加Cre重组酶靶向序列loxP位点，构建条件性基因敲除载体，转染胚胎干细胞(ES细胞)，再进行显微注射制作可用于条件型基因敲除的floxed小鼠，再与相应组织特异性的Cre小鼠交配，可获得能在特定组织敲除Loxl3基因的小鼠。该方法制得小鼠作为腭裂疾病发病研究的模型鼠，有利于详细阐明Loxl3基因在组织中的功能以及对胚胎发育调控的机理中的作用。同时该小鼠还可以作为研究Loxl3基因功能的动物模型，具有重要的应用价值。

主权项

一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法，其特征在于，出生后纯合敲除小鼠表现腭裂症状，包括如下步骤：构建Loxl3条件性基因敲除的重组载体，步骤如下：(1)提取含有loxl3基因的细菌人工染色体(BAC)；(2)PCR扩增六段同源重组片段，所述的引物序列分别为：同源重组片段A：F：GGACTAGTAGCAGCTTCAGCTTCAGACAC；R：CGGGATCCTGGTCTCTGTCTCGGTGACTC；同源重组片段B：F：CGGGATCCGGGCCTTGAAAGTTCAGAGTT；R：GCTCTAGACACTAGCACCACGTTCTACCC；同源重组片段C：F：ACGCGTCGACTCTAACTGCATGGGTCTTGCT；R：GGAATTCCACCATAACCTTCCCTGGTTT；同源重组片段D：F：CGGGATCCTTTGCAAAGGGAAAGGAGAGT；R：ATAAGAATGCGGCCGCCTAGTCCAGAGCATCGCTCAC；同源重组片段E：F：CCGCTCGAGCTGGACTAGCCCGGACATTAT；R：GGAATTCCATTCGGATACCATTCACCTGC；同源重组片段F：F：CGGGATCCACCAGCAAGCAGGAACTCAT；R：ATAAGAATGCGGCCGCTGTTTGTTTCTGTGCCAAGC；(3)分别将同源重组片段A和同源重组片段B连入质粒pL253，同源重组片段C和同源重组片段D连入质粒pL452，同源重组片段E和同源重组片段F连入质粒pL451，分别制得重组质粒pL253+A+B、重组质粒pL452+C+D、重组质粒pL451+E+F；(4)将含有loxl3基因的BAC转化入EL350菌株，然后通过第一次同源重组，将质粒pL253+A+B转化入含有BAC的EL350菌株，获得Retrieved质粒；再通过第二次同源重组，将重组质粒pL452+C+D和Retrieved质粒共转化入EL350菌株，获得含有A+C+Neo+D+B片段的二次同源重组质粒；利用Cre‑loxP系统去除Neo序列，获得去掉Neo的二次同源重组质粒；最后通过第三次同源重组，将重组质粒pL451+E+F和去掉Neo的二次同源重组质粒共转化入EL350菌株，获得含有A+C+D+E+Neo+F+B片段的三次同源重组质粒，即为Loxl3条件性基因敲除的重组载体；线性化重组载体并转染胚胎干细胞；筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆；将筛选出的发生同源重组的胚胎干细胞克隆显微注入C57BL/6供体小鼠的囊胚；将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠；嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠回交生出杂合子小鼠；将该杂合子小鼠与全身性表达Cre酶的EIIa‑Cre小鼠交配，获得双杂合的小鼠；雌性和雄性双杂合小鼠互交，从后代中获得具有腭裂表型的纯合基因敲除小鼠。