[发明专利]一种培养脐血类胚胎干细胞的方法及鉴定和应用

摘要

一种培养脐血类胚胎干细胞的方法及鉴定和应用，它涉及一种培养干细胞的方法及鉴定和应用。培养方法为一、脐血的采集；二、脐血的分离；三、脐血类胚胎干细胞培养皿的包被；四、脐血类胚胎干细胞的培养扩增。本发明的脐血类胚胎干细胞用于辅助恢复损伤的淋巴细胞。本发明培养基配方采用了多种细胞因子，稳定细胞维持生物特性，促进细胞增殖。本发明采用laminin(层粘连蛋白)对培养皿进行包被，laminin有助于细胞贴壁，有效缩短了细胞贴壁时间，提高了细胞与皿底的粘连程度，使细胞贴壁更牢固。

主权项

一种培养的脐血类胚胎干细胞的应用，其特征在于它制备用于辅助恢复糖尿病人损伤的淋巴细胞的药物，所述的脐血类胚胎干细胞的培养方法，是按照以下步骤进行的：一、脐血的采集二、脐血的分离将步骤一采集的脐血与分离液按体积比例为2:1混合，离心收集单核细胞层，随后用红细胞裂解液除去红细胞，再用PBS清洗单核细胞2次，计数，将细胞密度调整至2×106/mL，备用；三、脐血类胚胎干细胞培养皿的包被首先将层粘连蛋白包被于皿底保持24 h后，用PBS清洗2次，再用培养基平衡10~20min，然后将步骤二分离后的脐血细胞按1×105/mL接入皿底，其中，所述的层粘连蛋白首先用PBS配制成10倍浓度的层粘连蛋白溶液，于‑20℃保存，使用时室温融化后，再用PBS稀释成1倍浓度的层粘连蛋白溶液使用；四、脐血类胚胎干细胞的培养扩增将步骤二细胞分离后的细胞接种在步骤三包被好的6孔培养板中，每孔接种2mL细胞悬液；然后将培养板放在温度为37℃、质量百分含量为8%的CO2的培养箱中培养至融合率为70%~80%，然后按每孔培养后的细胞平均接种至两孔的标准进行传代培养，即完成培养脐血类胚胎干细胞；其中，步骤三中的培养基配方如下：含有质量百分含量为87%的RPMI1640培养液、质量百分含量为10%的胎牛血清、质量百分含量为1%的非必需氨基酸、质量百分含量为1%的谷氨酰胺和质量百分含量为1%的β‑巯基乙醇；并添加胰岛素至终浓度为5μg/mL、bFGF至终浓度为20ng/mL、Vc至终浓度为50μg/mL和白血病抑制因子至终浓度为20ng/mL；步骤二中分离液为淋巴细胞分离液，其密度为1.076~1.078g/mL；步骤四中传代培养前需用浓度为5mg/ml盐酸利多卡因与4mM EDTA的混合溶液，将上一代在培养板上培养的细胞在室温下孵育5~8分钟，再进行下一代传代培养，其中EDTA的pH为8.0；脐血类胚胎干细胞细胞抗原为Oct‑4+、SSEA‑3+、SSEA‑4+、CD45+、CD3‑、CD8‑、CD11b‑、CD14‑、CD20‑和CD34‑。