[发明专利]用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计方法

摘要

本发明公开了一种用于多靶点基因扩增的Arm‑PCR引物设计方法，其是通过以下步骤实现的：a、用LAMP软件代替icubate2.0在线软件设计小片段靶基因的引物；b、将LAMP软件设计出的内引物前面的成环引物序列换成Arm‑PCR引物的通用接头序列；c、Arm‑PCR反应体系的配制；d、Arm‑PCR反应条件的设定与运行；e、Arm‑PCR产物的毛细管电泳检测。本发明采用LAMP软件设计出的引物组较多，有利于多重引物组的筛选，本发明用于多靶点基因扩增的Arm‑PCR引物设计方法，可以使小片段靶基因的Arm‑PCR引物得以成功设计，进而使Arm‑PCR多重反应变得简单可行。

主权项

1.一种用于多靶点基因扩增的Arm‑PCR引物设计方法，其特征在于：所述用于多靶点基因扩增的Arm‑PCR引物设计方法是通过以下步骤实现的：a、用LAMP软件代替icubate2.0在线软件设计小片段靶基因的引物：将靶基因片段的序列导入LAMP软件中，按照Arm‑PCR引物设计的参数对LAMP软件中的参数进行调整；b、将LAMP软件设计出的内引物前面的成环引物序列换成Arm‑PCR引物的通用接头序列，从而转换成Arm‑PCR引物；c、Arm‑PCR反应体系的配制；d、Arm‑PCR反应条件的设定与运行；e、Arm‑PCR产物的毛细管电泳检测；引物组包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向内引物Fi、反向内引物Ri，用于Arm‑PCR的第一步扩增；5’端ROX标记的超级上游引物Fs和下游引物Rs用于Arm‑PCR的第二步扩增；利用Arm‑PCR检测引物组进行Arm‑PCR反应，包括如下步骤：以转基因大豆A5547‑127和转基因大豆GTS 40‑3‑2NOS终止子的质粒为模板；PCR扩增反应：在PCR管中配制第一步反应体系：引物液2.5μl，反应液Mix 12.5μl，转基因大豆A5547‑127和GTS 40‑3‑2NOS终止子质粒各2～5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置空白对照反应时，用双蒸水代替模板；将配制好的PCR管混匀后离心，并于95℃15min，94℃30s，60℃90s，72℃60s，15个循环；94℃15s，70℃90s，6个循环；60℃延伸30min，最后4℃保存；第二步PCR反应体系为：超级引物液1μl，反应液Mix 12.5μl，第一步PCR反应产物1～2μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；将配制好的PCR管混匀后离心，并于95℃15min；94℃30s，60℃90s，72℃60s，30个循环；60℃延伸30min，最后4℃保存；结果判断：通过毛细管电泳检测Arm‑PCR扩增结果；引物的核苷酸序列分别如下所示：1)A5547‑127正向外引物Fo：CACAAGAGTGGATTGATGATCTAG；A5547‑127反向外引物Ro：CTCATGCAACCTAACAGATGG；A5547‑127正向内引物Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGGTTGGTTGCTGAGGTTG；A5547‑127反向内引物Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGCCTATAACAGCAACCACAG；2)GTS 40‑3‑2NOS终止子正向外引物Fo：CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；GTS 40‑3‑2NOS终止子反向外引物Ro：CTAGTAACATAGATGACACCG；GTS 40‑3‑2NOS终止子正向内引物Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACAGATTGAATCCTGTTGCC；GTS 40‑3‑2NOS终止子反向内引物Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；3)超级上游引物Fs：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC；超级下游引物Fs：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT。