[发明专利]一种mir-505双等位基因敲除的方法

摘要

本发明涉及一种mir‑505双等位基因敲除的方法，包括：构建两种针对mir‑505基因的打靶载体，在哺乳动物细胞中通过CRISPR/Cas系统介导打靶载体对mir‑505基因进行替换敲除，利用G418抗性筛选得到mir‑505单等位基因敲除细胞，并在该细胞基础上再一次利用CRISPR/Cas系统和绿色荧光打靶载体作用对另一条mir‑505进行敲除，通过荧光筛选得到mir‑505双等位基因敲除的细胞。本发明为构建基因彻底敲除细胞模型提供帮助，具有良好的应用前景。

主权项

1.一种mir‑505双等位基因敲除的方法，包括：(1)将pIRES‑neo2载体经Xho I酶切后，将扩增得到的3’同源臂，通过同源重组的方法插入到pIRES‑neo2载体的Xho I位点；然后载体经Nru I酶切后，将扩增得到的5’同源臂，通过同源重组的方法插入到neo‑Xho I载体的Nru I位点，得到neo‑Xho I‑Nru I载体；(2)将pIRES‑neo2载体在克隆位点双酶切后，将从pEGFP‑C1载体上切割下来的EGFP基因插入载体中，得到neo‑EGFP载体；载体经Xho I酶切后，将扩增得到的3’同源臂，通过同源重组的方法插入到neo‑EGFP载体的Xho I位点；然后载体经Nru I酶切后，将扩增得到的5’同源臂，通过同源重组的方法插入到neo‑EGFP‑Xho I载体的Nru I位点，得到neo‑EGFP‑Xho I‑Nru I载体；其中，步骤(1)和(2)扩增得到3’同源臂的引物为：EGFP‑505‑R‑F：CCAGCTGGGGCTCGAGGGAGCATCGCCAAGTTCG；EGFP‑505‑R–R：CTAGAATGCACTCGAGGCCAGTGCCTCCTTCTGA；步骤(1)扩增得到5’同源臂的引物为：EGFP‑505‑L‑F：TTTTGCGCTGCTTCGCGAACGCTTGCGGATGTGATT；EGFP‑505‑L–R：CTGGCCCGTACATCGCGATTGGTCCTTGGCTGGTGT；步骤(2)扩增得到5’同源臂的引物为：505‑L‑F：TTTTGCGCTGCTTCGCGAAAGAGGGTGAATGCATGGGA；505‑L–R：CTGGCCCGTACATCGCGACTGGAAGCTTGCACATGGTT；步骤(1)和(2)中的3’同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用Hotstart Taq酶特异性扩增得到的858bp mir‑505基因的3’同源臂；步骤(1)中的5’同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用Hotstart Taq酶特异性扩增得到的1559bp mir‑505基因的5’同源臂；步骤(2)中的5’同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用Hotstart Taq酶特异性扩增得到的444bp mir‑505基因的5’同源臂；(3)将CRISPR/Cas系统载体和neo‑Xho I‑Nru I载体共同转染哺乳动物细胞，将mir‑505基因被外源neo基因替换，通过G418抗性筛选得到mir‑505单等位基因敲除细胞；再一次将CRISPR/Cas系统载体和neo‑EGFP‑Xho I‑Nru I载体共同转染mir‑505单等位基因敲除细胞，将另一条mir‑505基因被外源EGFP和neo基因替换，挑选得到表达绿色荧光蛋白的细胞即mir‑505双等位基因敲除细胞；具体步骤如下：实验前将HEK293A细胞以1.5×105细胞/孔的密度铺于24孔板中，确保各孔细胞生长状态良好，密度相仿，待细胞为单层并处于对数中期，细胞汇合度在70％～80％时进行转染；将neo‑Xho I‑Nru I载体和CRISPR系统载体共转染HEK293A细胞，转染后细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育24小时；24小时后，将细胞消化下来，重新铺到6孔板中，待细胞贴壁后，加入700ug/ml浓度G418进行抗性筛选；大约每3天更换新鲜培养基和添加新的G418；加药筛选4周后存活的细胞则为mir‑505单等位基因敲除细胞。