[发明专利]一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法

摘要

一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，包括以下步骤：根据鼠李糖脂合成酶RhlAB基因序列，设计扩增RhlAB基因的引物，以野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的染色体为模板，进行PCR反应扩增RhlAB基因，并应用纯化试剂盒对目的基因切胶回收纯化，将纯化得到的RhlAB基因酶切转入大肠杆菌‑铜绿假单胞菌穿梭表达载体pAK1900中，获得新的质粒pAK1900‑AB，将构建好的表达载体pAK1900‑AB，采用热激法转化的方法导入受体菌铜绿假单胞菌感受态细胞中，涂布羧苄抗性平板，PCR验证所构建工程菌；摇瓶发酵，采用硫酸‑蒽酮法测定鼠李糖脂的产量，极大降低了鼠李糖脂的生产成本，为鼠李糖脂的工业化应用奠定了基础，具有促使鼠李糖脂高产的优点。

主权项

1.一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，包括以下步骤：1)根据鼠李糖脂合成酶RhlAB基因序列，设计用于扩增RhlAB基因的引物，为WA：3’‑gaatcgaattcatgcggccgaaagtctgt‑5’，WB：3’‑cggtaagctttcaggacgcagccttcagcc‑5’；其中，所述RhlAB基因含鼠李糖基转移酶自身启动子和结构基因RhlA与RhlB；2)以野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的染色体为模板，进行PCR反应扩增RhlAB基因，反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测其大小和纯度，并应用纯化试剂盒对目的基因切胶回收纯化；3)将纯化得到的RhlAB基因酶切转入大肠杆菌‑铜绿假单胞菌穿梭表达载体pAK1900中，获得新的质粒pAK1900‑AB；4)将构建好的表达载体pAK1900‑AB，采用热激法转化的方法导入受体菌铜绿假单胞菌感受态细胞中，涂布羧苄抗性平板，PCR验证所构建工程菌；5)摇瓶发酵，取200μL铜绿假单胞菌工程菌接入处于200mL锥形瓶中的20mL种子培养基，于37℃、180r/min条件下摇瓶培养12h，然后以10％接种量(v/v)接入处于500mL锥形瓶中的200mL发酵培养基，温度为37℃、转速180r/min，发酵时间为7d；6)采用硫酸‑蒽酮法测定鼠李糖脂的产量。