[发明专利]产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选及所获基因

摘要

本发明涉及一种产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选及所获基因，通过重组质粒的构建来获得具有高效产该β-甘露聚糖酶的重组菌株的方法,以及重组酶的分离纯化和酶学性质测定，本该β-甘露聚糖酶产生菌经过对该重组菌株的发酵最高酶活可以达到484.5U/mL。对该β-甘露聚糖酶分离纯化及酶学性质研究，该酶比酶活可达8500U/mg,分子量大小约为37kDa，酶的最适温度及pH分别为50℃和5.5，金属离子Hg2+和Ag+，该菌株产生的β-甘露聚糖酶最适酶解温度为50℃，最适pH为5.5。该β-甘露聚糖酶耐碱能力良好，能够在pH3-11保持良好的稳定性。非常适合作为饲料的添加剂。

主权项

一种产耐酸耐蛋白酶β‑甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于：步骤如下(1)初筛：通过LB固体培养基三区划线将来自实验室的枯草芽孢杆菌纯化和活化37℃培养24h，将平板上长出的单菌落依次点接到筛选平板培养基上，37℃培养24h，将配好的刚果红倾倒于长出茵落的筛选平板上，10～15min后，倒去刚果红溶液，用物质的量浓度为l mol/L的NaCI溶液反复冲洗2‑3次，加入NaCI溶液静置15min后倒掉，此时，产生β‑甘露聚糖酶的茵落周围将会出现透明圈，将具有透明圈直径较大的的菌落进行斜面保存；(2)斜面保存：将筛选出的产生β‑甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株划线于斜面培养基上，在30℃恒温培养箱内培养24h，然后置于4℃冰箱保存；(3)复筛：将初筛得到的菌株进行发酵，利用发酵产生的粗酶液进行耐酸耐蛋白酶实验；(4)实验方法：1mL粗酶液加入到9mL50mM pH2.0的甘氨酸‑盐酸缓冲液中，37℃，120r/min，孵育1h。按照侧酶活的标准方法进行酶活测定，并选取酶活残留率较高的上述孵育液1mL，加入到含有0.1％胰蛋白酶的9mL 20mM pH5.5乙酸‑乙酸钠缓冲液中37℃继续孵育2小时，按照测酶活的标准方法进行酶活测定，选取酶活残留率最高的菌落即为产耐酸耐蛋白酶β‑甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌，进行甘油管保存；(5)甘油管保存：将产耐酸耐蛋白酶活力强的枯草芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基中37℃摇床培养24h，将0.5ml新鲜培养菌液与0.5ml 60％高温灭菌甘油分装于1.5mlEP管中充分混合后，标号后置于‑70℃冰箱保存。