[发明专利]一种测定转录调控复合体的方法

摘要

本发明涉及一种测定转录调控复合体的方法，属于分子生物学领域。本发明测定转录调控复合体的方法包括以下步骤诱饵DNA序列的制备、编码条形码蛋白的DNA序列制备、条形码蛋白库的构建、转录调控复合体的筛选、转录调控复合体的原位邻近连接捕获和转录调控复合体的鉴定。本发明结合cDNA展示技术与邻近连接技术，建立了一种测定转录调控复合体的新方法，转录调控复合体的测定涉及多种蛋白‑蛋白和蛋白‑DNA相互作用的同时测定，该方法可实现在同一实验体系中同时测定蛋白‑蛋白和蛋白‑DNA的多种相互作用，有效地解决了现有技术中蛋白‑蛋白互作和蛋白‑DNA互作测定方法的在同一实验体系中的不兼容性。

主权项

一种测定转录调控复合体的方法，其特征在于：包括以下步骤：诱饵DNA序列的制备：先进行重叠延伸PCR，再以重叠延伸PCR的产物为模板，扩增全长的诱饵DNA序列，最后以脱硫生物素修饰的碱基序列为引物进行扩增，得到带有脱硫生物素位点的DNA双链，即为诱饵DNA序列；编码条形码蛋白的DNA序列制备：以cDNA文库为模板进行PCR扩增，采用两步PCR或连接Adapter的方法在PCR扩增产物上添加通用序列，获得全长编码条形码蛋白的DNA序列文库；其中，通用序列5’端包含体外转录元件、体外翻译元件、增强子元件和酶切位点，3’端包含纯化标签序列、间隔序列和接头的互补序列；条形码蛋白库的构建：以构建的全长编码条形码蛋白的DNA序列文库为模板进行体外转录生成mRNA，降解模板DNA，mRNA与嘌呤霉素接头连接，进行体外翻译，形成核酸‑蛋白质二元复合物，再反转录得到mRNA/cDNA‑蛋白复合物；降解mRNA/cDNA杂交双链，加入带有脱硫生物素修饰的引物，使用Klenow Fragment合成cDNA第II链，形成cDNA‑蛋白融合体；使用纯化标签进行预筛选，去除多余的核酸以及由于移码突变造成错误或者截短翻译的蛋白，获得纯化的全长条形码蛋白库；转录调控复合体的筛选：采用固相筛选或液相筛选的方法筛选转录调控复合体；所述固相筛选的方法为：先将条形码蛋白与固相载体孵育，去除与固相载体非特异结合的条形码蛋白，保留上清，再将诱饵DNA序列固定于带有链霉亲和素的固相载体上，并与上清中条形码蛋白孵育，获得特异互作的转录调控复合体；然后，通过生物素竞争性结合释放相互作用转录调控复合体，利用条形码蛋白所带的纯化标签序列进行纯化；转录调控复合体的原位邻近连接捕获：先通过脱硫生物素修饰的诱饵DNA序列纯化条形码蛋白库，去除未发生互作的条形码蛋白，将筛选后的诱饵DNA序列及条形码蛋白的cDNA序列使用DNA聚合酶补齐末端，用DNA连接酶进行邻近连接，降解蛋白质；然后通过条形码蛋白中cDNA第II链的脱硫生物素进行第二次纯化，去除未发生连接的诱饵DNA序列；转录调控复合体的鉴定：采用巢式PCR扩增邻近连接捕获的产物，然后检测PCR扩增产物。