[发明专利]一种同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种同时检测水稻四种病毒的多重PCR检测方法，通过对水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus，RGDV)、水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus，RRSV)、南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black‑streaked dwarf virus，SRBSDV)和水稻黑条矮缩病毒(Rice black‑streaked dwarf virus，RBSDV)的引物浓度、酶的用量和PCR扩增条件等的优化，建立了一种同时检测水稻四种病原的方法。本方法主要包括以四种病毒基因序列为模板设计特异扩增引物；样品总RNA的提取；四重PCR优化；PCR扩增产物的凝胶电泳检测及结果分析。本发明实现了对田间复合侵染的水稻样品的快速检测，检测结果可靠、准确、特异性强，并缩短了检测时间，有利于研究田间4种病害的发生程度，在农业生产上具有重要的指导意义，为制定科学的病虫害防控体系提供了理论依据。

主权项

一种同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法，四种病毒为水稻瘤矮病毒(RGDV)，水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)，南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，扩增引物的设计；步骤二，样品总RNA的提取；步骤三，单重RT‑PCR检测；步骤四，四重RT‑PCR优化；步骤五，四重RT‑PCR的灵敏度分析；其中，步骤一中先下载病毒基因组序列，然后对下载的序列进行同源比对，以RGDV S8、RRSV S8、RBSDV S6和SRBSDV S10为模板，设计特异引物，利用BLAST在线软件检测特异引物，四种病毒的引物具体如下：水稻瘤矮病毒的引物为：上游引物：5’‑GTACTCAGACCTGAACGTAGT‑3’下游引物：5’‑CTCAATAGCGATCGCATACC‑3’水稻齿叶矮缩病毒的引物为：上游引物：5’‑CGCCGTATCTAACGTTCCAG‑3'下游引物：5'‑TGCCGCGACATAATCAAC‑3’南方水稻黑条矮缩病毒的引物为：上游引物：5’–CGCGTCATCTCAAACTACAG‑3’下游引物：5’‑TTTGTCAGCATCTAAAGCGC‑3’水稻黑条矮缩病毒的引物为：上游引物：5’‑AATGCCACTTGCCAGTTACG‑3’下游引物：5’‑GCTACTTCGTCAGTTAGATC‑3’；步骤三中的单重RT‑PCR检测包括以下步骤：(1)一步法RT‑PCR扩增：PCR反应体系为：20μl反应体系中，2×1step buffer 10.0μl，PrimeScript 1step Enzyme Mix 0.5μl，RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV各1μl上下游引物混合物和1.0μl RNA模板，最后补水至20μl；PCR反应参数为：50℃反转录30min，94℃预变性2min；然后94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环；最后在72℃延伸10min，降温至10℃结束反应；(2)PCR产物电泳检测：取6μl PCR产物与1μl 6×上样缓冲液相混合，室温下进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为电压100V，时间40min，电泳结束后于凝胶成像系统观察电泳结果；(3)电泳结果分析：分别得到RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV的扩增条带，依次约为244bp、397bp、682bp和1000bp，其大小与理论值相符；步骤四的四重RT‑PCR优化包括以下步骤：(1)引物浓度比例的优化：设置了4个引物浓度组合：第一组：RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物μmol/L均为0.125μmol/L；第二组：RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物μmol/L分别为0.2、0.125、0.125和0.25μmol/L；第三组：RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物μmol/L分别为0.2、0.125、0.125和0.3μmol/L；第四组：RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物μmol/L分别为0.25、0.25、0.25和0.3μmol/L；按照单重RT‑PCR检测方法，进行多重RT‑PCR反应；(2)DNA聚合酶用量的优化：对Taq DNA聚合酶的用量设为四个梯度：2.5U、4U、5U和6U四个梯度，按照单重RT‑PCR检测方法，进行多重RT‑PCR反应；(3)退火温度的优化：最后对退火温度进行优化，从52℃到62℃每1℃为一个梯度，按照单重RT‑PCR检测方法，进行多重RT‑PCR反应；在步骤四中，根据优化的结果，多重PCR最佳反应体系为：2×1step buffer10.0μl，RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV引物的终浓度依次为：0.2、0.125、0.125和0.25μmol/L，PrimeScript 1step Enzyme Mix 2.5U，退火温度为58℃，RNA模板为1.0μl，最后补水至20μl；最后PCR反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性2min；然后94℃30s，58℃30s，72℃1min，共35个循环；最后在72℃延伸10min，降温至10℃结束反应。