[发明专利]抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY制备方法及其制剂

摘要

本发明涉及抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY制备方法及其制剂。采用基因工程或偶联法或常规方法将霉菌毒素、细菌外毒素和病原体制成抗原，分别对产蛋禽类进行免疫，制得抗霉菌毒素、抗细菌外毒素和抗病原体免疫蛋，然后制得不同类型的IgY粗提物；再进行提纯、纳米化、包被及复合，分别得到不同状态的抗霉菌毒素IgY、抗细菌外毒素IgY、抗病原体IgY以及抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY；将上述IgY或复合IgY按0.0001％以上的任意比例添加到食品、饲料、保健品或药品中，即得抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体IgY或复合IgY制剂。采用这种IgY或复合IgY及其制剂可有效降解饲料和食品以及粮食中的霉菌毒素，预防和治疗霉菌毒素和细菌外毒素中毒及混合感染疾病。

主权项

一种抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备抗原：选取霉菌毒素、细菌外毒素或病原体，采用基因工程重组蛋白或偶联载体蛋白或常规方法，分别制成抗原；(2)将步骤(1)制备出的霉菌毒素抗原、细菌外毒素抗原或病原体抗原其中的一种或混合多种按(10‑1)∶(1‑10)的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制得不同种类的免疫用抗原；(3)将步骤(2)制备出的免疫用抗原对产蛋禽类进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，分别检取产蛋禽类所产免疫蛋，并进行编码标记，即可分别制得相对应的抗霉菌毒素IgY免疫蛋、抗细菌外毒素IgY免疫蛋和抗病原体IgY免疫蛋；(4)将步骤(3)制得的抗霉菌毒素IgY免疫蛋、抗细菌外毒素IgY免疫蛋或抗病原体IgY免疫蛋用流动水洗净，酒精擦洗消毒，再用打蛋机打碎免疫蛋，采用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；再按蛋黄液体积的3‑8倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0mol/L HCl溶液调pH至5.5‑6.5；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2‑15℃，静置12‑24小时；将稀释液于10,000rpm下离心20分钟；取分离所得的上清液置于超滤器中进行超滤浓缩10‑20倍；继而加入重量百分数2.0％的海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入重量百分数2.0％CaCl2溶液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，30‑40℃静置8‑12小时；8,000rpm下离心20分钟，取上清液，用0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌；然后用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥，即分别制得抗霉菌毒素IgY粗提物、抗细菌外毒素IgY粗提物和抗病原体IgY粗提物；(5)将步骤(4)中制得的抗霉菌毒素IgY粗提物、抗细菌外毒素IgY粗提物或抗病原体IgY粗提物分别溶解于pH7.0、0.01mol/L磷酸盐缓冲液中，再依次分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，冷冻干燥或低温喷雾干燥，即相应制得抗霉菌毒素IgY纯干粉、抗细菌外毒素IgY纯干粉和抗病原体IgY纯干粉；(6)将步骤(5)中制得的抗霉菌毒素IgY纯干粉、抗细菌外毒素IgY纯干粉或抗病原体IgY纯干粉，加入到超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1‑100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，即相应制得抗霉菌毒素IgY纳米粉、抗细菌外毒素IgY纳米粉和抗病原体IgY纳米粉；(7)制备IgY纳米脂质体液晶微囊：把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将步骤(6)中制备的抗霉菌毒素IgY纳米粉、抗细菌外毒素IgY纳米粉或抗病原体IgY纳米粉加入4mmol/L磷酸盐缓冲液配成抗毒素IgY纳米粉溶液，超声处理2min(每处理0.5min，间歇0.5min)，立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心(35000r/min，30min)分离除去未包入的抗毒素IgY纳米粉，将沉淀用水洗二次，离心，取沉淀，用10mmol/L磷酸盐缓冲液稀释，即相应制得抗霉菌毒素IgY纳米脂质体液晶微囊、抗细菌外毒素IgY纳米脂质体液晶微囊和抗病原体IgY纳米脂质体液晶微囊；(8)将步骤(4)‑(7)所得的4组产物组内复合，即得4种状态的多种抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY。