[发明专利]IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法

摘要

本发明公开了一种IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法，该IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法利用ELISA方法检测血浆或血清中IL-11的表达；IL-11属于IL-6因子家族。本发明测定浆中/血清中IL-11的水平将对胰腺癌的早期诊断及预后的评价具有参考价值，有利于胰腺癌的早期诊断和预后评估。此外，本发明的方法灵敏度高，方法简单，血浆/血清标本获得简单无创，可重复性强。

主权项

一种IL‑11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法，其特征在于，该IL‑11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法利用ELISA方法检测血浆或血清中IL‑11的表达；IL‑11属于IL‑6因子家族；具体包括以下步骤：步骤一，采用血浆/血清样本，用EDTA抗凝/无抗凝采血管抽取2‑3mL静脉血，室温静置5分钟后，4000rmp/min，离心5分钟，获取上清备用；样本通常24小时内完成检测，对于复查的标本；标本离心后，放置‑80℃冰箱长期保存备用；所有的试剂和样本在使用之前放置在室温18℃‑25℃；所有的样本复空；步骤二，用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，对血浆/血清样本1∶2稀释；步骤三，用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，溶解IL‑11蛋白质标准品粉末，充分震荡混匀后；制备成4ng/ml的标准品；取100ul的4ng/ml的标准品，加入400ul的稀释液，配制成800pg/ml的标准品，在6管分别加入400ul的稀释液，800pg/ml的标准品中移出200ul，进行倍比稀释，分别得到266.7pg/ml、88.89pg/ml、29.6pg/ml、9.88pg/ml、3.29pg/ml、0pg/ml；步骤四，加入100ul的标准品于IL‑11抗体包被的96孔板中，血浆/血清/细胞上清/其他体液样本1∶2稀释，用薄膜覆盖孔后，室温孵育2.5小时或者4℃过夜，并轻微震荡；步骤五，用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，将山羊抗人IL‑11抗体稀释为2μg/ml；在聚苯乙烯的96孔酶标板的微孔中加入50μl包被液，用保鲜膜封好，在4℃冰箱中放置过夜；次日，用350μl 150mM的PBST缓冲液浸泡式洗板，3min×3次；步骤六，每孔加入300μl的2％BSA，室温封闭4h；用350μl PBST缓冲液浸泡式洗板，1min×3次；步骤七，丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中彻底清除液体；在最后一次洗涤时，去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在吸水纸上排干；共洗涤4次；步骤八，在每孔中加入100ul生物素标记的IL‑11抗体，室温孵育1小时，并轻微震动；丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中清除液体；在最后一次洗涤时，去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在吸水纸上排干；共洗涤4次；步骤九，加入100ul链亲和素溶液于每孔中，室温孵育45分钟并震荡；丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中清除液体；在最后一次洗涤时，去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在吸水纸上排干；共洗涤4次；步骤十，加入100ul的TMB底物试剂于每孔中，室温避光震荡孵育30分钟；加入50ul 2M H2SO4溶液终止反应；在酶标仪Model 680酶标仪中读取450nm吸光值；步骤十一，结果的判读：首先确定3个阴性对照孔的读数，取平均值作为本底读数；对于每一例血浆/血清/细胞培养液/其他体液样品或IL‑11标准品，先计算3个平行孔的孔间变异系数CV，对于CV值小于10％的样品，取3次重复的平均值作为样品的OD值；CV值大于10％的样品，去除一个异常值后，重新计算孔间变异，孔间变异＝两孔OD值之差/两孔OD值之和，变异值＜12％，样品为有效病例，并取两孔平均值作为样品的OD值，否则，舍弃该例样品，利用梯度稀释的IL‑11标准品绘制标准曲线，从而计算出每一例有效病例的血浆/血清/细胞培养液/其他体液的IL‑11浓度。