[发明专利]一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法

摘要

本发明提供了一种高效的将人胚胎干细胞诱导分化为肝细胞的方法。该方法以肿瘤抑制因子P53及Wnt5a重组蛋白作为分化诱导剂，在分化培养初期采用低氧培养，之后在细胞发育不同时期添加包括甲胎蛋白（AFT）、胰岛素等在内的肝细胞生长因子促进诱导分化。本发明也提供了由所述方法获得的肝细胞，这些从人胚胎干细胞起源的肝细胞具有正常肝细胞的形态和亚细胞结构如毛细胆管等，表达肝细胞特异的蛋白质，如甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK18），而且还具有肝脏特异的糖原储存功能。

主权项

一种胚胎干细胞定向分化为肝细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： 1）胚胎干细胞的体外培养，培养体系为含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基，其中添加0.1mmol/L 2‑巯基乙醇，25mM HEPES，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，1000U/ml重组小鼠白血病抑制因子（LIF），培养条件为常氧、5%CO2、37℃； 2）拟胚体的形成：培养体系为去除胚胎干细胞培养体系中的LIF，同时将胎牛血清浓度调整为15%；将胚胎干细胞以3×104‑5×104/ml浓度接种于未经过促细胞黏附作用处理、瓶底光滑的玻璃培养瓶中摇动培养法，1天后便会有大量的拟胚体生成，形成成熟拟胚体；将成熟的囊性拟胚体用胰蛋白酶消化为单个细胞，培养条件为常氧、5%CO2、37℃； 3）诱导分化阶段Ⅰ：培养体系为诱导培养体系Ⅰ，培养条件为4%O2、5%CO2、37℃，所述的诱导培养体系Ⅰ是将胎牛血清浓度调整为10%的拟胚体形成阶段培养体系，并加入肿瘤抑制因子P53，浓度是0.16U/ml，肿瘤抑制因子Wnt5a，浓度是100ng/ml，培养时间为2天； 4）诱导分化阶段Ⅱ：培养体系为诱导培养体系Ⅱ，培养条件为常氧、5%CO2、37℃，所述的诱导培养体系Ⅱ是将胎牛血清浓度调整为10%的拟胚体形成阶段培养体系，并加入20ng/ml甲胎蛋白（AFP），100ng/ml酸性纤维细胞生长因子（αFGF），30ng/ml人成纤维细胞生长因子4（FGF4），培养时间为3天； 5）诱导分化阶段Ⅲ：培养体系为诱导培养体系Ⅲ，培养条件为常氧、5%CO2、37℃，所述的诱导培养体系Ⅲ是将胎牛血清浓度调整为10%的拟胚体形成阶段培养体系，并加入20ng/ml肝细胞生长因子（HGF），10ng/ml制瘤素（OSM），20ng/ml角质细胞生长因子（KGF），培养时间为3天； 6）诱导分化阶段Ⅳ：培养体系为诱导培养体系Ⅳ，培养条件为常氧、5%CO2、37℃，所述的诱导培养体系Ⅳ是将胎牛血清浓度调整为10%的拟胚体形成阶段培养体系，并加入10‑7M地塞米松（DEX），0.8%二甲基亚砜（DMSO），5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，培养时间为2天。