[发明专利]一种支原体中药最低抑菌浓度检测新方法

摘要

本发明涉及一种支原体中药最低抑菌浓度检测新方法，该方法对传统的药敏实验方法进行改进，利用其生长过程中的代谢产物改变培养基的pH值这一点，发明新方法，用pH计检测支原体培养物的pH值，通过pH值的高低来判定中药对支原体的最低抑菌浓度，并通过对培养条件的处理、试管尺寸的改进替代96孔板、pH计所得数据中，将下降阶段数据第一个与(‑)试管数据差值大于等于‑1的试管，该试管的前一试管中的药物浓度，即为最低抑菌浓度。本发明相对传统方法操作更为简单、便捷，通过精密pH计配合数据处理方法，使颜色较深的中药对支原体的最低抑菌浓度的判断更为方便、直观、准确，该方法尤其适用于颜色较深的中药的支原体MIC检测。

主权项

一种支原体中药最低抑菌浓度检测新方法，其特征是：该方法包括以下步骤：步骤1)：取目标中药，将所述目标中药通过煎煮、浓缩为0.5g/mL的药液，高压灭菌；对待检支原体培养物进行复苏，并准备液体培养基；所述的待检支原体培养物复苏方法为，将冻存的支原体菌种融化后，按一定质量比1:9比例加到新鲜的培养液中，于37℃培养，即可复苏支原体；所述的液体培养基为改良Freg氏液体培养基，其原料配方为，NaCl—5.0g、KCl—0.4g、MgSO4·7H2O—0.2g、Na2HPO4·12H2O—1.6g、KH2PO4—0.2g、葡萄糖—10g、乳蛋白水解物—5g、酵母粉—5g、1％半胱氨酸溶液—10mL、2﹪精氨酸溶液—20mL、猪血清—100mL、1﹪粉红溶液—1.0mL、10万单位/mL青霉素—10mL、1﹪醋酸托溶液—10mL；称取上述各成分，加水至1000mL用1.0﹪mol/L的NaOH调pH值至7.6～7.8，0.22um孔径筛滤、除菌、分装，﹣20℃保存；所述中药为大黄、桔梗、黄连；支原体为鸡毒支原体；步骤2)：取12支长度为7cm、半径为1.5cm的玻璃试管，灭菌后依次编号为“(‑)、①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩、(+)”，放入合适的试管架上；步骤3)：向(‑)试管中加入2mL步骤1)所述液体培养液；向①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩、(+)11支试管中各加1mL步骤1)所述液体培养液；步骤4)：向①试管中加入1mL步骤1)所述药液，将①试管中药液与液体培养液用移液器充分混匀，然后递倍稀释至第⑩管；所述递倍稀释具体操作为，将①试管中的液体培养液和培养液用移液器充分混匀后，取1mL移入②试管，并与②试管中的液体培养液混匀，再从②试管中取1mL移入③试管，以此类推至⑩试管，最后从取⑩试管混匀液中取1mL弃掉；所述(‑)、①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩、(+)12支试管中的药物浓度为分别为0、125mg/mL、62.5mg/mL、31.25mg/mL、15.625mg/mL、7.8125mg/mL、3.9063mg/mL、1.9531mg/mL、0.9766mg/mL、0.4883mg/mL、0.2441mg/mL、0；步骤5)：向①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩、(+)11支试管中，各加入0.8mL液体培养液和0.2mL菌液的混合液；步骤6)：将12支试管塞紧胶塞，在无光条件下于37℃恒温箱中培养7～15天培养；通过pH计来测定各管内培养物的pH值；步骤7)：将经步骤6)处理的12支试管，通过精密pH计来测定(‑)、①～⑩、(+)管内培养物的pH值，取依次记录数据；①～⑩试管数据为一先升后降的pH变化趋势，找到其下降阶段数据中，第一个与(‑)试管数据差值大于等于‑1的试管，该试管的前一试管中的药物浓度，即为最低抑菌浓度。