[发明专利]快速鉴定西瓜新品种红和平杂交种子纯度的方法以及采用的引物和试剂盒

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及快速检测西瓜‘红和平’杂交种子纯度的方法以及采用的引物和试剂盒。西瓜‘红和平’种子纯度的鉴定方法，该方法包括以下步骤一、根据已公布的西瓜基因组序列进行SSR引物开发；二、取单粒西瓜种仁进行基因组DNA的提取；三、用开发的SSR引物在亲本及杂交一代中进行PCR扩增及电泳，获得存在差异的引物及在凝胶上的相对位置，制作为‘红和平’品种标准图谱；四、待测样品种子纯度鉴定。相比于传统田间鉴定(需要80～100天)，该方法仅需1～2天，且具有不依赖季节、快速、准确、低成本等优点，能够替代传统西瓜杂交种鉴定方法。本发明可在‘红和平’的制种、繁种、经销企业推广应用。

主权项

西瓜新品种‘红和平’种子纯度的鉴定方法，其特征在于该方法包括以下步骤：一、根据公布的西瓜新品种基因组序列进行全序列的下载；随后，使用Mreps 2.5SSR序列鉴定程序，鉴定DNA序列上含SSR的序列区段；设计出跨越SSR位点的PCR引物200对，交予南京金斯瑞公司合成；西瓜新品种actin基因如SEQ ID NO:1所示；二、西瓜新品种种仁基因组DNA的提取，步骤如下：1）取1.5ml离心管，加入200ml新鲜配制SDS的提取缓冲液，SDS的提取缓冲液包括0.5M NaCl，0.1M Tris.HCl，0.05M Na.EDTA，12%SDS；2）取1粒种子，用镊子去除种壳后，将种仁放到上述离心管中，玻璃棒研磨至糊状，再用600ml提取缓冲液冲洗玻璃棒；3）颠倒混匀后65℃水浴15min，期间每隔5min混匀一次，水浴结束后短暂离心；4）加入500ml氯仿∶异戊醇=24：1混合液，翻转混匀，12,000rpm离心5min，转移600ml上清转入一新的1.5ml的离心管中；5）加入500ml氯仿，翻转混匀，12,000rpm离心5min，转移400ml转入一新的1.5ml的离心管中；6）加入1000ml的‑20℃预冷的无水乙醇，缓慢翻转50次混匀，静置5min，10,000rpm，室温离心5min，弃上清；7）于沉淀中加入1ml 70%的乙醇洗涤，12,000rpm离心2min；倒掉上清液，通风干燥;8）加入25ml含有1ml RNase A，10mg/ml的TE缓冲液溶解，37℃温育30min；9）取1.5ml在1%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，结果表明，本方法得到的DNA比较清晰，且无拖尾现象，样品间重复性好；三、 ‘红和平’西瓜新品种基因组DNA的PCR检测以西瓜新品种内源基因ACTIN为模板设计引物，引物序列为：W‑actinF: 5'> AATGTGCCTGCTATGTATGTCG <3'; W‑actinR: 5'> GATGGAGTTGTAGGTAGTTTCG <3'； PCR反应体系总体积25ml，于200ml离心管中加入基因组DNA50ng、10pmol/ml引物各1ml， 12.5ml Mix ，Mix 包括10×Buffer，dNTP，Mg2+，TaqDNA聚合酶，灭菌双蒸水补充到25ml，同时设置以无菌水代替基因组DNA的空白对照实验；混匀后置于PCR反应仪上进行扩增；PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共40个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存；取8ml扩增产物加入2ml上样缓冲液于1%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，用凝胶成像系统成像记录；四、利用上游引物：5＇‑CCAAGAAACGAGAAATTCGC‑3＇和下游引物：5＇‑GCAAGCTCCTCCATAAACCC‑3＇制备西瓜新品种“红和平”种子纯度标准图谱1）DNA的提取：取5粒“红和平”F1、1粒父本、1粒母本，去除种皮后，利用SDS法分别提取基因组DNA；2）PCR反应体系及扩增程序与步骤三中相同，扩增结束后在扩增产物中加入5ml上样缓冲液，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯酰胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚蓝刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后再可见光下观察、照相；该图即为‘红和平’标准图谱；五、待测样品种子纯度鉴定利用PHF/PHR引物，将待测样品种子按上述步骤四同样的工艺分别制备出指纹图谱后，再分别与‘红和平’品种标准图谱进行比对；如果相同，即可确定为‘红和平’杂交种，否则为杂种。