[发明专利]羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法

摘要

本发明涉及羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法。传统的羊口疮病毒都是从结痂和患病羊的口唇皮屑中分离的，分离周期长，需要盲传5代后才会有病变，同时，病料来源范围小，限制的羊口疮病毒的研究工作。本发明使用特有的Virus holder溶液对唾液、乳汁、内脏等样品进行离心过滤处理后，接种于牛睾丸原代细胞中培养后弃去毒液；加细胞维持液培养后收毒；反复冻融收集细胞培养物，从第3代接种牛睾丸细胞后的72h可观察到细胞病变。本发明使用特有的Virus holder溶液处理样品，能够从病毒含量极低的样品中分离羊口疮病毒，取材范围大，病毒分离周期短，稳定性高，能够很好的保持病毒的完整性和活性。

主权项

羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法，其特征在于：由以下步骤实现：步骤一：材料的处理：唾液、乳汁样品的处理方法：12000～16000r/min离心5～10min后，取200μL上清，加入800μL Virus holder 溶液，反复冻融3次，0.22µm滤膜过滤，滤液‑20℃保存备用；内脏样品处理方法：取0.5g样品，用无菌PBS洗2～3次，剪碎后加入1mL Virus holder 溶液用匀浆器研磨至匀浆状，反复冻融3次，3000～5000r/min离心5～10min后取上清，0.22µm滤膜过滤，滤液‑20℃保存备用；步骤二：病毒分离：取1mL滤液接种于已铺满培养瓶瓶底80%～90%的牛睾丸原代细胞，37℃，5%CO2培养箱孵育1～1.5h后弃去毒液；加5～10mL细胞维持液，37℃，5%CO2培养72h后收毒；反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物，从第2代开始接毒600uL，在第3代接种牛睾丸细胞后的72h可观察到细胞病变；步骤一中，Virus holder 溶液包含Tris 0.01 mol/L、NaCl 0.15 mol/L和EDTA 0.005 mol/L；Virus holder 溶液的配置方法为：先称取Tris放入洗净的烧杯中，再称取NaCl 放入烧杯中，然后加入EDTA，再加入500 mL双蒸水，搅拌至完全溶解，调整pH到8.0，配好的溶液用0.22µm滤膜过滤后，4℃保存备用。