[发明专利]一种高拷贝基因串联体的快速构建方法

摘要

本发明一种高拷贝基因串联体的快速构建方法，涉及分子生物学领域。具体涉及多聚化法构建串联多拷贝。该方法为一锅法反应，不需要对载体进行去磷酸化和纯化回收，操作步骤少而且简单，获得的基因拷贝数高，8拷贝以上的串联基因占了总数的66%（对照例为10%），同时利用该步骤获得的基因同样可以进一步采用递归定向连接法获得更高拷贝的基因。

主权项

1.一种用于高拷贝基因串联体的快速构建方法，其特征在于，（1）改造载体在载体多克隆位点或者其他区域插入一段含有A、B和C 3个限制性核酸内切酶识别序列的双链寡核苷酸链；其中所述3个限制性核酸内切酶在双链寡核苷酸链上共用一段酶切位点序列，其中限制性核酸内切酶A的识别序列位于所述酶切位点序列的一侧，限制性核酸内切酶B的识别序列位于所述酶切位点序列的另一侧，且限制性核酸内切酶A和B反向共用所述酶切位点序列；限制性核酸内切酶C的识别序列位于所述酶切位点序列的两侧；所述3个限制性核酸内切酶的酶切位点在改造后的载体上是唯一的；限制性核酸内切酶A和B选自BbsⅠ、BveⅠ和AarⅠ，限制性核酸内切酶C选自AasⅠ、DraⅢ和BglⅠ；（2）获得目的基因获取带有5’磷酸化粘性末端的目的基因dsDNA，该基因的粘性末端与所述载体经限制性核酸内切酶A或B酶切后形成的粘性末端一致；其中所述目的基因的获取方法选自化学合成法、PCR产物酶切法和质粒酶切法；（3）一锅法反应在支持多种分子生物学工具酶共同工作的缓冲溶液中加入改造后的载体，目的基因，限制性核酸内切酶A或B，T4连接酶，18~23℃，反应30~120 min；反应结束后，灭活所述限制性核酸内切酶和连接酶，所述灭活的方法选自热灭活或氯仿‑乙醇沉淀法；在灭活后的体系中加入限制性核酸内切酶C和T4连接酶，18~23℃，反应20~60 min；（4）转化感受态细胞反应结束后的体系用于转化感受态大肠杆菌。