[发明专利]鲍曼不动杆菌携带qacE*1-sull基因的检测方法

摘要

本发明公开了一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测鲍曼不动杆菌中是否携带耐消毒剂qacE∆1-sull基因的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：提取菌株样本DNA，设计目的基因的检测引物，根据高分辨熔解曲线分析技术对PCR扩增后的基因进行分析。本发明灵敏度高、特异性好，检测速度快。

主权项

一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测鲍曼不动杆菌中耐消毒剂qacE∆1‑sull基因携带情况的方法其特征在于，具体步骤为：第一步：从临床分离环境标本中的鲍曼不动杆菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带qacE∆1‑sull基因的铜绿假单胞菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成qacE∆1‑sull序列，构建携带qacE∆1‑sull基因的重组质粒为阳性对照品；全部菌株均使用法国梅里埃公司VITEK32全自动微生物分析仪鉴定菌种;第二步：用无菌水配制浓度为5‑15umol/L的qacE∆1‑sull基因正向引物溶液以及浓度为5‑15umol/L的qacE∆1‑sull基因反向引物溶液；qacE∆1‑sull基因正向引物的序列为：5′‑ tcggtgttgcttatgcagtc‑3′，qacE∆1‑sull基因反向引物的序列为：5′‑ gcaattatgagccccatacc‑3′；第三步：在每一个PCR反应孔中依次加入Type‑it HRM PCR Mix 7.5ul和第二步所得的qacE∆1‑sull基因正向引物溶液0.5ul、qacE∆1‑sull基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul；在Rotor‑Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92‑97℃变性5‑15分钟，92‑97℃变性10‑30秒，57‑65℃退火10‑30秒，70‑75℃延伸10‑30秒，30‑50个循环；HRM反应条件：92‑97℃变性1分钟，40℃复性1分钟，初始熔解温度60‑65℃开始程序升温熔解至95℃，过程中实时监测荧光信号，30‑50次每秒;第四步：应用Rotor‑Gene Q软件分析HRM结果，有扩增曲线的即为携带qacE∆1‑sull基因。