[发明专利]基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法

摘要

本发明公开了一种基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法，它包括（1）寡核苷酸DNA链末端修饰的小分子配体与其靶蛋白的特异性分子识别；（2）结合抑制点击化学反应；（3）基于由铜纳米颗粒和氧化石墨烯组成的荧光淬灭纳米探针体系的荧光定量检测。该方法灵敏度高、特异性强、操作简便，且具有良好的普适性，因而在临床诊断和药物研发等领域中具有巨大的潜在应用价值。

主权项

一种基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法，其特征在于该方法的具体步骤为：（a）设计并合成三条末端分别修饰叠氮基团、小分子配体和炔基基团的寡核苷酸DNA单链；其中，修饰有叠氮基团的寡核苷酸DNA单链 P1的序列为：5'‑Azide‑GAAGTCATGAGCGTATGAGTA‑3'，修饰有小分子配体的寡核苷酸DNA单链P2的序列为：5'‑TACTCATACGCTCATGACTTC‑小分子配体‑3'，修饰有炔基基团的寡核苷酸DNA单链P3的序列为：5'‑CGATCCAGGTCATGC‑Alkyne‑3'；（b）单链P1和单链P2互补杂交形成DNA双链，且杂交形成双链后叠氮基团和小分子配体位于双链的同一侧末端；具体步骤为：将单链P1和单链P2按1:1的摩尔比混合于MOPS缓冲溶液中，搅拌均匀后在20~30 ºC条件反应2~3小时，以使P1和P2链互补杂交形成双链；（c）将含有待测的小分子配体靶蛋白的样品溶液加入步骤（b）所得的P1‑P2双链溶液中，通过靶蛋白与小分子配体间的特异性分子识别，形成靶蛋白结合的P1‑P2双链；识别结合反应时间为1~2小时，反应温度为30~40 ºC；（d）向步骤（c）所得反应体系中加入单链P3，P3链和P1‑P2双链的摩尔比为1:1，再加入还原剂抗坏血酸，混合均匀后加入含有二价铜离子的MOPS缓冲溶液，以进行点击化学反应并合成铜纳米颗粒；反应所用时间为20~40分钟，温度为20~30 ºC；所述的P3链和抗坏血酸的摩尔比为1 : 2000~3000， P3链和二价铜离子的摩尔比为1 : 200~300；（e）向步骤（d）所得反应体系中加入氧化石墨烯，使反应体系中氧化石墨烯和P3链的终浓度比为25~50 ug/mL：1 uM；混匀后在20~30 ºC条件下反应20~40分钟以进行荧光淬灭；反应结束后，使用荧光光谱仪记录反应体系最终的荧光图谱，并根据荧光发射强度实现对小分子配体靶蛋白的定性定量检测。