[发明专利]一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒及定量方法

摘要

本发明公开了一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒及定量方法，通过核酸互补杂交，目标小RNA特异性识别3‑WJ引物、3‑WJ模板并形成稳定的三元杂交结构，3‑WJ引物沿着硫代修饰的3‑WJ模板起始链置换扩增反应并产生大量带有酶切位点的单链SDA产物。该单链DNA打开分子信标的茎环结构，其荧光恢复。分子信标与SDA产物形成的双链互补结构中含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被切口酶识别，被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，被释放后的SDA产物可与新的分子信标形成杂交双链，产生更多的荧光信号。该定量方法及试剂盒灵敏度高，通过硫代修饰模板，巧妙的实现了链置换扩增反应的级联放大。

主权项

基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，其特征在于，包括：与目标小RNA形成三元杂交结构的组合物，包括3‑WJ引物和3‑WJ模板：3‑WJ引物由两部分序列组成，5'端部分与目标小RNA 3'端部分互补，3'端部分与3‑WJ模板的中间段互补；3‑WJ模板由三部分序列组成，3'端部分与目标小RNA 5'端部分互补，中间段与3‑WJ引物3'端部分互补，5'端部分为含两个核酸切口酶识别位点的链置换扩增SDA模板区域，其中一个切口酶识别位点经过硫代修饰；扩增底物，包括dNTPs混合物；工具酶，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶，用于触发SDA产生带有内切酶位点的SDA产物；带有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与SDA产物相互补的序列；与SDA产物互补的分子信标探针序列中含有核酸切口酶Nt.BbvCI的酶切位点；以及扩增反应缓冲液；缓冲液包括：KAc、Tris‑HAc、Mg(Ac)2及DTT；3‑WJ引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；含有酶切位点的硫代修饰的3‑WJ模板的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；分子信标探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；其两端分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL。