[发明专利]镉强诱导启动子CdS2及其应用

摘要

本发明公开了一种植物基因序列。本发明从日本晴水稻中分离克隆和鉴定了一个镉(Cd)强烈诱导的水稻特异基因的启动子Cd S2，并对获得的转基因水稻进行镉(Cd)处理，经过GUS化学染色发现，在处理后转基因植株在各个部位都有明显的染色。且通过RT‑qPCR鉴定处理前后的Gus基因表达量分析发现，镉(Cd)处理后，转基因植株中的Gus基因表达量是处理前的887.9倍，达到组成型启动子ACTIN活性的4倍。该启动子能够用于通过其在水稻中的表达量来反应土壤中镉污染的强度，其操作简单、检出限低、微量灵敏且准确度高的特性，对从研究环境关系到改善生态环境，在可持续发展中发挥重要意义，并且可以积极地对形成污染的原理进行分析，进一步为它们避免与可控转化提供宝贵经验。

主权项

1.一种植物镉强诱导表达启动子CdS2在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述植物镉强诱导表达启动子CdS2由SEQ ID No:1所示的DNA序列构成，所述应用包括：将消毒后的水稻种子用无菌水在30℃黑暗条件下浸泡过夜，用解剖刀将胚剥下置于诱导培养基上，每皿均匀放置12个胚，在30℃黑暗条件下放置2～3周诱导愈伤组织，至长出淡黄色颗粒状愈伤组织；从诱导培养基上挑选颗粒状、不带病斑的愈伤组织置于新的诱导培养基上，于30℃黑暗条件下培养3～5d；将预培养的愈伤组织转移至50mL无菌管中，加入超表达载体的农杆菌菌液浸泡20min，倒出菌液，并用无菌滤纸将残余菌液吸干，后将愈伤组织均匀撒在共培养培养基上，于23℃黑暗条件下培养2～3d；将共培养的愈伤组织转移至恢复培养基上，愈伤组织之间尽量避免重叠，23℃黑暗培养3～5d；从筛选培养基上挑选不带菌斑颜色鲜亮呈淡黄色颗粒状的抗性胚性愈伤组织，每皿30粒接种于筛选培养基，30℃黑暗培养2～3周，至长出新的抗性颗粒状愈伤组织；每一转化事件挑选三个独立的胚性愈伤组织到分化培养基某一区域，30℃光照培养室条件下培养3～4周，待幼苗长出；每一区域挑选两棵健壮的幼苗移栽至生根培养基，30℃组织培养室光周期，16h光照/8h黑暗，培养三周左右，进行鉴定并移栽至田间；对所培养出的水稻种子，进行镉处理，经镉处理后，Gus基因表达量是处理前的887.9倍；其中，超表达载体如下构建：根据所述植物镉强诱导表达启动子CdS2的序列设计扩增引物，以日本晴水稻基因组DNA为模板进行PCR扩增，加A连T载体转化大肠杆菌，选取正确的T载体阳性克隆提取质粒，用限制性内切酶SalI和SmaI对含目的片段的质粒和pCAMBIA1391质粒进行双酶切，分别回收目的片段和pCAMBIA1391质粒的大片段进行连接，用Progema T4连接酶连接目的片段和pCAMBIA1391载体大片段，4℃冰箱过夜连接16‑18h，该连接产物即为超表达载体。