[发明专利]一种基于双酶修饰电极快速检测溶液中氨基甲酸乙酯含量的电化学方法

摘要

一种基于双酶修饰电极快速检测溶液中氨基甲酸乙酯含量的电化学方法，属于食品安全检测技术领域。本发明将氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶共修饰至电极表面构建出氨基甲酸乙酯电化学传感器。氨基甲酸乙酯降解酶将氨基甲酸乙酯水解生成乙醇、CO2和氨，在谷氨酸脱氢酶催化下氨与共底物α‑酮戊二酸反应生成谷氨酸，同时伴随着还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化。从而该体系将氨基甲酸乙酯含量转化成NADH含量的变化，利用后者在电极表面产生电流信号的变化，实现对液态体系中氨基甲酸乙酯含量的检测。该方法能够快速检测溶液及模拟黄酒体系中的氨基甲酸乙酯，检测限低至5.26 nmol·L‑1，为发酵食品和饮料中氨基甲酸乙酯的检测提供了有效的手段。

主权项

一种快速检测溶液中氨基甲酸乙酯含量的电化学方法，其特征在于利用氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶催化的级联反应将氨基甲酸乙酯信号转换成还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸信号进行电化学检测，氨基甲酸乙酯降解酶将氨基甲酸乙酯水解生成乙醇、CO2和氨，在谷氨酸脱氢酶催化下氨与共底物α‑酮戊二酸反应生成谷氨酸，同时伴随着还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸被氧化，利用特定电压下还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在电极表面氧化产生电流信号的变化，对氨基甲酸乙酯含量进行电化学检测；步骤为：（1）构建双酶修饰电极将0.2%壳聚糖、0.3%明胶和3% γ‑(2,3‑环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷加入25 mL 1%醋酸溶液中制备壳聚糖/silane溶胶‑凝胶体系，将氨基甲酸乙酯降解酶40 U·mL‑1和谷氨酸脱氢酶16 U·mL‑1加入此有机无机杂化材料中制备壳聚糖/明胶/γ‑(2,3‑环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷/氨基甲酸乙酯降解酶/谷氨酸脱氢酶生物复合材料，滴加在石墨电极表面，置于4℃冰箱中干燥成膜，构建成双酶修饰电极；双酶修饰电极用于氨基甲酸乙酯检测时反应体系为25 mmol·L‑1 PBS缓冲液，pH为6.0，反应体系中α‑酮戊二酸的浓度为10 mmol·L‑1；还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为0.5 mmol·L‑1；（2）建立标准曲线将双酶修饰电极置于含有0～500 μmol·L‑1浓度氨基甲酸乙酯、300 mmol·L‑1α‑酮戊二酸200 μL、和7.5 mmol·L‑1还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸400 μL，用pH6.0、25 mmol·L‑1PBS缓冲液定容至6 mL，将所得的溶液混合均匀后，立即插入双酶修饰电极，施加0.55 V电压，进行电流‑时间扫描，反应5 min，观察还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在电极表面产生的电流响应曲线在120 s时的电流响应变化值，将氨基甲酸乙酯浓度和电流响应曲线在120 s处的电流响应值在5 min内的变化值对应，制作标准曲线；（3）计算样品中氨基甲酸乙酯含量将双酶修饰电极置于待测黄酒样品中反应5 min后，检测还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在电极表面产生的电流响应曲线在120 s处的电流响应变化值，通过对比标准曲线计算待测黄酒样品中氨基甲酸乙酯含量。