[发明专利]一种脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法

摘要

本发明公开了一种脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法，包括如下步骤：(1)2-3代奶牛乳腺上皮细胞的获取；(2)CCK-8法检测LPS对奶牛乳腺上皮细胞增殖的抑制作用，初步找出符合建立体外细胞损伤模型细胞凋亡率在40-50％指标要求的LPS作用浓度及作用时间；(3)流式细胞术检测乳腺上皮细胞凋亡率；(4)DNA ladder检测凋亡细胞核酸的变化情况；(5)透射电镜观察乳腺上皮细胞内部形态结构变化；本发明所述的LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型诱导条件的测定方法具有效果理想、成本低、操作简便的优点。

主权项

一种脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)培养奶牛乳腺上皮细胞，获取2‑3代对数生长期细胞用于后续试验；(2)取所述2‑3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板，随机分为6个试验组，用CCK‑8法检测所述6个试验组的细胞抑制率；所述6个试验组的设置条件为：向所述6个试验组96孔板每孔中分别加入含不同质量浓度LPS的培养液100μL，所述不同质量浓度分别为0、10、20、50、100和200μg/mL，所述6个试验组的作用时间段设置均分别包括3、8、16和24h；每组/每时间段3个复板；选取所述LPS质量浓度为0μg/mL的试验组为对照组，对所述6个试验组各时间段得到的细胞抑制率进行统计学分析；找出所述细胞抑制率在40％～50％之间的试验组及其作用时间段；经统计分析得出以下结果：所述细胞抑制率在40％～50％之间的所述试验组及其作用时间段为50μg/mL LPS作用于奶牛乳腺上皮细胞24h和100μg/mL LPS作用于奶牛乳腺上皮细胞8h；(3)根据步骤(2)的结果，取所述2‑3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，以5×10⁵个/mL的密度每孔吸取2.5mL接种于6孔板，随机分成3个试验组，每组3个复孔；用流式细胞术检测所述3个试验组的细胞凋亡率；所述3个试验组的设置条件为向所述3个试验组6孔板每孔中分别加入含0μg/mL质量浓度LPS的培养液2.5mL作用24h、含50μg/mL质量浓度LPS的培养液2.5mL作用24h、含100μg/mL质量浓度LPS的培养液2.5mL作用8h；选取所述0μg/mL LPS作用细胞24h的处理组为对照组，并对所述3个试验组细胞凋亡率进行统计学分析；找出所述细胞凋亡率在40％～50％之间的试验组；经统计分析得出以下结果：所述细胞凋亡率在40％～50％之间的所述试验组为100μg/mLLPS作用于奶牛乳腺上皮细胞8h组；(4)根据步骤(2)的结果，取所述2‑3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，以5×10⁵个/mL的密度每皿吸取5mL接种于25cm²培养皿中，随机分成3个试验组，每组3个复皿，用1％琼脂糖凝胶电泳检测所述3个试验组的细胞DNA完整性；所述3个试验组的设置条件为向所述3个试验组25cm²培养皿每皿中分别加入含0μg/mL质量浓度LPS的培养液5mL作用24h、含50μg/mL质量浓度LPS的培养液5mL作用24h、含100μg/mL质量浓度LPS的培养液5mL作用8h；选取所述0μg/mL LPS作用细胞24h的处理组为对照组，比较分析所述3个试验组细胞的DNA Ladder电泳图，找出具有典型细胞凋亡DNA梯状带电泳图谱的试验组；经比较分析得出以下结果：所述具有典型细胞凋亡DNA梯状带电泳图谱的所述试验组为100μg/mL LPS作用于奶牛乳腺上皮细胞8h组；(5)根据步骤(3)和(4)的结果，选择所述LPS质量浓度100μg/mL为作用浓度，8h为作用时间，进一步从细胞形态学上验证所述奶牛乳腺上皮细胞凋亡时的内部超微形态变化特征；取所述2‑3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，以5×10⁵个/mL的密度每孔吸取2.5mL接种于6孔板中，随机分成2个试验组，每组3个复孔，用透射电镜观察术检测所述2个试验组的细胞内部超微形态学变化；所述2个试验组的设置条件为向所述2个试验组6孔板每孔中分别加入含0μg/mL质量浓度LPS的培养液2.5mL作用8h和含100μg/mL质量浓度LPS的培养液2.5mL作用8h；选取所述0μg/mL LPS作用细胞8h的处理组为对照组，找出所述细胞内部超微形态出现典型凋亡特征的试验组；经比较分析得出以下结果：所述细胞内部超微形态出现典型凋亡特征的所述试验组为100μg/mL LPS作用于奶牛乳腺上皮细胞8h组；综合比较分析步骤(2)、(3)、(4)、(5)的结果得出如下结论：确定100μg/mL LPS作用于奶牛乳腺上皮细胞8h为建立脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的诱导条件。