[发明专利]一种用于抗菌药物筛选的新载体

摘要

本发明公开了一种用于抗菌药物筛选的新载体，所述载体为pKD‑0011，主要用于筛选对铜绿假单胞菌的致病性和耐药性有明显抑制作用的抗菌药物。载体以耐药性及治病性双相关基因PA0011作为药物作用靶点，通过带有缺失启动子的报道基因luxCDABE的质粒pMS402，将耐药及致病双相关基因PA0011的启动子区域通过PCR扩增、酶切克隆到报道质粒pMS402荧光素酶操纵子基因前，构成启动子‑报道子融合载体pKD‑0011；利用电转化技术将重组质粒转入野生型的铜绿假单胞菌中，利用载体pKD‑0011的发光强弱可以筛选得到抑制PA0011表达的抗菌物质。该载体可以实现高通量筛选，利用相关筛选设备，操作简单，经济实用。

主权项

1.一种用于降低铜绿假单胞菌广谱耐药性和感染性的双效药物筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以铜绿假单胞菌PAO1的耐药及致病双相关基因PA0011作为药物靶点，以带有缺失启动子的报道基因luxCDABE的质粒pMS402为载体，将PA0011基因的启动子区域经PCR扩增、酶切克隆到报道质粒pMS402所带的荧光素酶luxCDA BE操纵子前，构成启动子‑报道子融合载体pKD‑0011；利用电转化技术将重组质粒pKD‑0011转入铜绿假单胞菌PAO1中，形成铜绿假单胞菌PAO1的抗耐药筛选载体pKD‑0011；2)通过检测pKD‑0011的发光情况来筛选获得抑制PA0011表达的抗菌物质，高通量筛可降低铜绿假单胞菌的耐药性和致病性的双效药物，具体步骤为：采用铜绿假单胞菌PAO1抗耐药筛选载体pKD‑0011，通过多孔板酶标仪BioTek synergy2对耐药及致病双相关基因PA0011有明显抑制作用的抗菌药物的高通量筛选，具体方法为：通过酶标检测仪进行基因表达检测：将检测菌株在LB固体培养基上划线、37℃过夜培养；挑取单克隆接种到含100μL LB培养基的白色96孔板中，37℃、200rpm培养12h；然后按5％接种量转接到新鲜LB培养基中，活化3h，取95μL含有或不含有亚抑制浓度药物成份的新鲜LB培养基作为对照组于已灭菌的黑色底部透明的96孔板中，同时加入5μL活化后的菌液；最后每孔用50μL矿物油覆盖，置于多功能酶标仪上，每隔0.5h测定其CPS值和OD600值，共测24h，得到对耐药及致病双相关基因PA0011有明显抑制作用的抗菌药物。