[发明专利]一种苏禽黄鸡胚胎干细胞特定基因进行靶向敲除方法

摘要

本发明公开了一种苏禽黄鸡胚胎干细胞特定基因进行靶向敲除的方法：首先查询出基因的外显子序列，克隆出基因，测序，获得完整的外显子序列，并在此序列上设计CRISPR/Cas9敲除靶位点作为gRNA，构建CRISPR/Cas9双启动子敲除载体；构建完成的Cas9载体进行SSA活性检测，对照组转染空载体，检测luciferase信号，luciferase活性相对于对照组增长的越多，则证明gRNA剪切活性越高；将具有高SSA活性的CRISPR/Cas9载体转染ESCs，流式细胞术筛选出GFP阳性细胞，提取基因组DNA，设计引物。

主权项

一种苏禽黄鸡胚胎干细胞特定基因靶向敲除方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)目的基因的获取根据基因序列号在NCBI数据库中查询目的基因在原鸡中的CDS序列，设计特异性引物，以苏禽黄鸡PGC的RNA反转录形成的单链CDNA为模板克隆并获得苏禽黄鸡中目的基因完整的CDS序列，通过比对得到完整的目的基因外显子序列；(2)gRNA设计及合成寻找获得的外显子序列中的PAM序列，将PAM序列前20bp左右的碱基作为靶序列，所有的靶序列在全基因组比对，无同源性的靶位点作为gRNA并合成；(3)CRISPR/Cas9基因敲除载体构建VK001‑08载体为基础载体进行载体改造，以禽源U6作为启动子启动gRNA的表达，T7启动最启动Cas9酶的表达，同时插入GFP荧光基因作为报告基因。(4)CRISPR/Cas9基因敲除载体SSA活性检测将终止子和靶位点插入Luciferase载体中，靶位点位于终止子后，共转染CRISPR/gRNA载体，以及新构建的luciferase报告基因和内参renilla质粒，对照组转染空载体，检测luciferase信号，luciferase活性相对于对照组增长的越多，则证明gRNA剪切活性越高；(5)CRISPR/Cas9基因敲除载体内源活性检测剪切活性较高CRISPR/Cas9基因敲除载体转染状态良好的第二代ESC，48小时后流式细胞术筛选出GFP阳性细胞，提取基因组DNA，设计引物，克隆出靶位点前后各250bp共计500bp左右片段，使用T7E1酶进行活性检测，若存在敲除活性，将产生非配对DNA片段，即能被非配对内切酶‑‑T7核酸内切酶I剪切；若没有发生突变，将产生配对DNA片段，而无法被非配对内切酶‑‑T7核酸内切酶I剪切；(6)CRISPR/Cas9基因敲除载体敲除效率检测CRISPR/Cas9基因敲除载体转染状态良好的第二代ESC，48小时后流式细胞术筛选出GFP阳性细胞，提取基因组DNA，设计引物，克隆出靶位点前后各250bp共计500bp左右片段，进行TA克隆，挑菌测序并与原始序列进行对比，计算CRISPR/Cas9基因敲除载体的具体效率，计算方法：(序列发生突变的菌液数/全部测序菌液数*100％)，注意测序的菌液需要足够多。