[发明专利]一种戊型肝炎病毒样颗粒疫苗的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种戊型肝炎病毒样颗粒疫苗的制备方法，属于生物医药技术领域。本发明对戊型肝炎病毒截断衣壳蛋白基因进行了密码子优化，采用原核表达系统的大肠杆菌菌株B834‑pRARE2，通过融合了纯化标签MBP表达、不同裂解剂进行筛选和组合，细菌膜抽提、麦芽糖直链淀粉亲和层析、分子筛层析除去MBP和非病毒结构蛋白，并促使病毒样颗粒的组装，使戊型肝炎病毒样颗粒纯度达99.0％以上，且没有有任何蛋白标签并具有生物活性(非包涵体形式，可溶性)。本发明戊型肝炎病毒样颗粒疫苗对猪、犬、鸡HEV感染产生完全保护，不同基因型HEV病毒之间有交叉保护性抗原。在动物上可作为一种疫苗，预防猪、犬、禽HEV引起的疾病和感染。

主权项

1.一种制备戊型肝炎病毒样颗粒疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成野生型戊型肝炎病毒全长ORF2基因，基因合成后，插入克隆质粒pGEM‑T；(2)合成戊型肝炎病毒截断的ΔORF2基因使用大肠杆菌喜好的密码子，设计编码戊型肝炎病毒112‑660位氨基酸的截断的ΔORF2基因，然后以野生型戊型肝炎病毒全长ORF2基因为模板，设计引物合成ΔORF2基因，合成的ΔORF2基因产物与同样酶切的pMAL‑p4x表达质粒片段连接；(3)戊型肝炎病毒截断的ΔORF2基因在大肠杆菌中的表达连接产物转化大肠杆菌B834‑pRARE2，挑选阳性克隆，测序，得到pMAL‑p4X MBP‑ΔORF2重组质粒；重组质粒pMAL‑p4xMBP‑ΔORF2接种LB培养基，按1:200～1:1000(V/V)转接到含有18L LB培养基的20L的发酵罐中，以250rpm转速37℃培养4～6h，菌液OD600达到0.6～0.8时，按浓度0.5～0.7mmol/L加入IPTG诱导4h，4000rpm离心25min，获得湿重为110～120g/L的菌体培养物；(4)戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白ΔORF2的提取和纯化a裂解剂筛选和细菌膜蛋白提取将步骤(3)得到的菌体培养物融化，重悬于层析缓冲液，用超声仪在冰浴中破碎细胞壁，超声液75,000g、4‑8℃离心1小时分离上清和沉淀，沉淀用溶解液溶解，加入裂解剂在4℃搅拌2h提取大肠杆菌膜蛋白，测定提取物的活性，以确定总蛋白和裂解剂的比例，提取物以100,000g超速离心1小时，获得可溶性上清，再用层析缓冲液稀释至最终裂解物的浓度为0.5‑1.0％(w/v)以便于后续纯化；其中，所述的层析缓冲液含有20mM NaH2PO4,100mM NaCl,1μM蛋白酶抑制剂E‑64、0.3mM三羧甲基磷酸，pH 7.5；所述的溶解液含有20mM Tris‑HCl,300mM NaCl,1mM 2‑巯基乙醇，pH 8.0；所述的裂解剂为Triton X‑100和DDM的混合物；b麦芽糖结合蛋白‑ΔORF2纯化在4℃条件下，20mL直链淀粉介质装柱、用3‑5倍柱体积的含1.0％(w/v)Triton‑X100和1.0％(w/v)DDM的平衡溶液平衡，含麦芽糖结合蛋白‑ΔORF2的上清液以2mL/min的速度进行虹吸上样，上样后用10倍柱体积的含1.0％(w/v)Triton‑X100和1.0％(w/v)DDM的平衡溶液洗涤，再用3倍柱体积的不含裂解剂Triton‑X100、DDM和EDTA的平衡溶液洗涤，最后用含20mM Tris,0.2M NaCl,10mM麦芽糖的pH 8.0的溶液洗脱，分步收集，测定蛋白含量、纯度；其中，所述的平衡缓冲液含有20mM Tris‑HCl,pH 8.0，300mM NaCl,1mM 2‑巯基乙醇,1mM EDTA；c酶切按75‑100ug蛋白加入1单位的Xa因子常温反应36‑48h，使酶切程度达到90‑95％；d抗麦芽糖抗体Sepharose 4亲和层析纯化酶切反应液与抗麦芽糖抗体偶联Sepharose 4亲和介质充分混合后，4℃孵育18‑24小时，吸附除去麦芽糖结合蛋白，收集流穿液，流穿液室温4000rpm离心后收获上清，在上清液获得纯化的戊型肝炎病毒ΔORF2蛋白，纯度检测可达90％；e分子筛层析纯化在上步流穿液离心后的上清液中，加入Triton X‑100使其终浓度为0.031％(w/v)，用截留值为20kDa的滤器离心浓缩至含5–10mg/mL蛋白，使用2500mL Superdex 2000 2/150柱进行分子筛层析，浓缩蛋白注射上样，层析柱用平衡液洗脱，分步收集洗脱液，收集液检测纯度和含量，合并收集洗脱液并用截留值为20KDa的超滤器透析浓缩，获得高度纯化的ΔORF2蛋白，纯度检测可达99.0％；其中，所述的平衡液含有10mM HEPES,pH 7.2,150mM NaCl,0.3mM TCEP,0.031％(w/v)Trioton X‑100；(5)戊型肝炎病毒样颗粒疫苗配制根据使用对象的不同，采用不同类型的佐剂，人作为使用对象时，纯化的ΔORF2蛋白按0.6‑0.7mg/mL加入佐剂氢氧化铝吸附，即得；猪、犬和鸡作为使用对象时，纯化的ΔORF2蛋白按1：3重量比加水包油包水佐剂乳化，即得。