[发明专利]一种两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法

摘要

本发明公开了一种两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型的方法。通过两核苷酸实时合成测序，每个测序反应同时代加入两个不同的核苷酸，且PCR产物中不同DNA模板的合成测序不同步，使得相邻两个SNP位点上不同碱基的信息是由不同测序反应所提供。根据这些不同步合成测序反应所得到的不同SNP位点上的测序信息进行关联分析，确定PCR产物单体型。本发明拓广了分析范围，操作简单、可以降低分析成本；适合多个混合样本的单体型分析，可以直接测定混合样本中各个单体型的比例，可以用于从大规模样本中寻找、筛选核酸标志物。

主权项

一种两核苷酸不同步合成测序分析PCR产物单体型方法，其特征在于：步骤包括：1)DNA提取；2)PCR扩增；3)测序；4)关联分析；所述步骤3)的测序方法为：同时加入两个不同的核苷酸，PCR扩增产物中不同DNA模板的合成测序不同步，得到相邻两个SNP位点上不同步的测序信息；所述步骤3)中，每个测序反应获得的测序信息包括两核苷酸种类信息和测序信号强度信息，所述测序信号强度与合成核苷酸数目成正比；所述步骤4)中，根据不同步合成测序反应所得到的相邻两个SNP位点上的测序信息进行关联分析，构建关联方程式，确定PCR产物单体型及含量；所述关联方程式为：对于包含任意相邻两个SNP位点的PCR产物，不超过四种不同的DNA模板；设定这四种单体型1、…、i的含量分别为x1、…、xi，其中2≤i≤4，且x1+……+xi＝1；则PCR产物中混合DNA模板单个测序反应测序信号强度fn、fn’与x1、…、xi存在下列关系：(fn‑fn’)＝a1nx1+…+ainxi；其中n表示第n次测序反应；fn、fn’分别表示第n次测序反应的测序信号强度与背景值；a1n、…、ain分别表示100％单体型DNA序列1、…、i在第n次测序反应中合成的核苷酸数目；所述SNP位点上的测序信息进行关联分析是指两个相邻SNP位点均是杂合型的单个样本的关联分析；若PCR产物中包含若干个SNP位点的分析，将其分解成相邻两个SNP位点的单体型关联分析。