[发明专利]一种结核分枝杆菌ESAT‑6蛋白检测试剂盒、制备方法以及使用方法

摘要

本发明涉及一种基于纳米免疫磁珠‑近红外荧光标记法的结核分枝杆菌ESAT‑6蛋白检测试剂盒。本试剂盒中，以近红外荧光染料标记靶向于ESAT‑6的单克隆抗体，靶向于ESAT‑6的多克隆抗体包被在纳米磁珠表面。采用双抗体夹心法原理，磁性分离结合物和游离物，采用便携式高灵敏度低噪声激发式荧光检测仪检测磁性结合物的荧光强度，从而检测待检样品中ESAT‑6蛋白含量。本发明适用于临床病理标本中的ESAT‑6检测，具有快速、灵敏、抗杂散荧光干扰、发射荧光保存时间长的特点。

主权项

一种基于纳米免疫磁珠‑近红外荧光标记法的结核分枝杆菌ESAT‑6蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述基于纳米免疫磁珠‑近红外荧光标记法的结核分枝杆菌ESAT‑6蛋白检测试剂盒由近红外荧光染料标记的单克隆抗体、多克隆抗体包被的纳米磁珠、磁性分离器、蛋白标准品、缓冲液组成；其中，近红外荧光染料标记的单克隆抗体为鼠抗ESAT‑6；包被纳米磁珠的多克隆抗体为鼠多抗ESAT‑6；建立ESAT‑6蛋白标准品梯度浓度和荧光发射值之间的工作曲线，将所测得的发射荧光强度，代入方程即可完成样品中目标蛋白含量的定量检测；所述基于纳米免疫磁珠‑近红外荧光标记法的结核分枝杆菌ESAT‑6蛋白检测试剂盒的制备方法，步骤如下：(1)制备近红外荧光染料标记的单克隆抗体；将购自Thermofisher公司的Dylight800用pH＝7.4的PBS缓冲液稀释10倍，取1.4μL与购自Pierece公司的1mg/ml的20μg鼠抗ESAT‑6单克隆抗体轻柔混合均匀后于室温避光反应2小时；反应结束后，将标记产物放入透析袋中，4℃，PBS缓冲液透析4小时；标记好的抗体溶液中添加终浓度为1.5％BSA和0.1％Tween20,叠氮化钠0.1‰，4℃保存；使用前将标记产物以PBS稀释2500倍；(2)制备ESAT‑6多克隆抗体包被的纳米磁珠，购自武汉哇哇噻纳技术开发有限公司北京生物技术研究所；1)纳米磁珠的预处理：轻轻混匀磁珠悬浮液，吸取25mg/ml的0.01ml悬浮液加入1.5ml EP试管中；再加入0.1ml重蒸水，轻轻混匀并将试管架置磁板上，静置2分钟后吸取上清液；重复上述步骤1次；加入1ml 0.1M的乙磺酸溶液，pH＝5.0，MES，重悬磁珠；2)纳米磁珠的活化将上述EP管置于磁板上，用1mlMES洗涤2次，弃上清；临用前配置终浓度为0.1M的MES，其内含EDC和NHS的浓度均为40g/L，加入上述两种物质后，置于振荡器上充分混匀15分钟，待用；用该液重悬磁珠；用磁板吸附磁珠，弃上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，弃上清；3)磁珠与蛋白的链接；在已处理好的磁珠中加入购自Pierece公司的50μL ESAT‑6多克隆抗体1mg/ml和pH值5.5的500μL PBS，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；用pH＝5.5，浓度为0.05％的Tween PBS缓冲液清洗3次，弃上清；加入0.1M，0.1％BSA的1ml Tris缓冲液，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；加入pH＝5.5，0.05％Tween 1ml PBS缓冲液，静置2分钟，弃上清；重复3次，加入pH＝5.5的1ml PBS缓冲液，弃上清，重复3次；弃上清时，试管需置于磁板上；加入pH＝7.4，0.05％Tween‑20，0.1％BSA，0.05NaN3的1ml PBS缓冲液，待用；(3)制备ESAT‑6系列标准品；购自杭州启泰生物公司的ESAT‑6全片段重组蛋白，浓度为1mg/ml，pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至1、5、50、250、1000ng/ml。