[发明专利]一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法

摘要

本发明公开了一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法。具体而言，本发明的方法包括下列步骤：1）获得病毒基因组；2）设计并合成引物；3）获得病毒基因组的cDNA；4）对cDNA进行PCR扩增；5）将扩增产物进行酶切，获得重组质粒；6）将重组质粒pT‑S1至pT‑S9进行酶切，体外转录获得对应的RNA；7）构建带有红色荧光蛋白基因的重组质粒pT‑S10‑DsRed并获得S10‑DsRed RNA；以及8）将上述RNA等摩尔混合，包裹并转染宿主，进而获得病毒。利用本发明建立的方法可以在家蚕细胞中表达红色荧光蛋白，进而有可能获得人们所需的重组质型多角体病毒生物杀虫剂。 1

主权项

1.一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法，其包括下列步骤：1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；2）根据家蚕质型多角体病毒基因组S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双链RNA的末端序列，设计并合成10对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的编号情况如下：引物PS1F对应SEQ ID NO:1，引物PS1R对应SEQ ID NO:2，引物PS2F对应SEQ ID NO:3，引物PS2R对应SEQ ID NO:4，引物PS3F对应SEQ ID NO:5，引物PS3R对应SEQ ID NO:6，引物PS4F对应SEQ ID NO:7，引物PS4R对应SEQ ID NO:8，引物PS5F对应SEQ ID NO:9，引物PS5R对应SEQ ID NO:10，引物PS6F对应SEQ ID NO:11，引物PS6R对应SEQ ID NO:12，引物PS7F对应SEQ ID NO:13，引物PS7R对应SEQ ID NO:14，引物PS8F对应SEQ ID NO:15，引物PS8R对应SEQ ID NO:16，引物PS9F对应SEQ ID NO:17，引物PS9R对应SEQ ID NO:18，引物PS10F对应SEQ ID NO:19，引物PS10R对应SEQ ID NO:20，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20所示；3）获得S1至S10片段的cDNA；4）分别以步骤3）中获得的S1至S10片段的cDNA为模板，对应使用步骤2）中合成的10对引物进行PCR扩增，获得S1至S10片段全长cDNA的扩增产物；5）将步骤4）中获得的S1至S10片段全长cDNA的扩增产物分别使用限制性内切酶进行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得分别带有S1至S10片段全长cDNA的重组质粒pT‑S1、pT‑S2、pT‑S3、pT‑S4、pT‑S5、pT‑S6、pT‑S7、pT‑S8、pT‑S9、pT‑S10，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：S1片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S2片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S3片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S4片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S5片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S6片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S7片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和XbaI进行酶切；S8片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S9片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S10片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；6）将步骤5）中获得的pT‑S1至pT‑S9重组质粒分别使用限制性内切酶进行酶切、线性化后，作为模板备用，经过体外转录，获得S1至S9片段的RNA，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：重组质粒pT‑S1用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S2用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S3用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S4用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S5用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S6用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S7用XbaI进行酶切；重组质粒pT‑S8用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S9用SacII进行酶切；7）构建带有红色荧光蛋白基因的重组质粒pT‑S10‑DsRed，将其进行酶切、线性化后，作为模板备用，经过体外转录，获得S10‑DsRed RNA，其中所述红色荧光蛋白基因的5'端带有对应于家蚕质型多角体病毒基因组S10片段的5'非编码区的cDNA序列、3'端带有对应于S10片段的3'非编码区的cDNA序列，所述重组质粒pT‑S10‑DsRed用SacII进行酶切；8）将步骤6）中获得的S1至S9片段的RNA及步骤7）中获得的S10‑DsRed RNA等摩尔混合，使用脂质体进行包裹并转染宿主，待观察到宿主的细胞内发出红色荧光时，收集细胞并粉碎，离心纯化，获得表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒。