[发明专利]几丁质酶基因chiC及其编码蛋白和应用

摘要

本发明涉及几丁质酶基因chiC及其编码蛋白和应用，属于基因工程技术领域。本发明以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL‑6)为研究对象，首次克隆出具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的几丁质酶基因chiC，并获得了高活性几丁质酶，其制备方法简单，生产成本低，产品易保存，适宜的酶解温度是30℃，酶解pH值为9.0，对胶体几丁质具有高降解活性可达1.569±0.017U/ml，几丁质酶chiC降解α几丁质和β几丁质生成几丁二糖，具有工业化生产前景。

主权项

1.一种几丁质酶chiC在降解含几丁质底物中的应用，其特征在于：所述几丁质酶chiC的表达与纯化方法步骤如下：(1)以PCR方法扩增如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；以Pseudoalteromonas sp.DL‑6菌株的基因组DNA为模板，以引物对chiC‑F和chiC‑R进行PCR扩增；上游引物chiC‑F：5’‑CCCGGATCCGGCGCCTTCTACACCAAGCATTAATTGG‑3’，下游引物chiC‑R：5’‑CCGCTCGAGAAGTGCTAACCATACATCGG‑3’；PCR反应体系：(2)构建大肠杆菌克隆载体pMD19‑T‑chiC：将PCR扩增的DNA序列和pMD19‑T simple载体用同样的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T₄ DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到克隆载体pMD19‑T‑chiC；连接反应体系为：连接反应的条件为：16℃过夜连接，构建克隆载体pMDl9‑T‑chiC；(3)构建大肠杆菌重组表达载体pET28a‑chiC：将克隆载体pMD19‑T‑chiC质粒转化至E.coli DH5α，得到阳性转化子，用限制性内切酶BamHI和XhoI将chiC基因片段从pMDl9‑T‑chiC质粒上切下，连接到pET‑28a表达载体上，连接pET‑28a表达载体的反应体系：pMDl9‑T‑chiC酶切产物chiC基因1μL，pET‑28a 2μL，5μL Ligation Mix，2μL dH2O，反应条件为：16℃过夜连接；(3.1)取冰上冻融的100μL大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，于上述10μL的连接反应液中，轻柔混合均匀；(3.2)冰中放置30分钟后，在42℃热激处理1min，然后立即转移冰中放置1min；(3.3)加入900μL的SOC培养液，37℃振荡培养1h；(3.4)取100μL涂平板LB/Kana，37℃过夜培养筛选阳性转化子；(3.5)重组原核表达载体pET28a‑chiC的提取，用TaKaRa公司试剂盒提取表达载体pET28a‑chiC；(4)构建大肠杆菌重组表达菌株BL21(DE3)‑pET28a‑chiC：将重组表达载体pET28a‑chiC质粒转化至E.coli BL21(DE3)，挑选阳性转化子克隆，得到重组表达菌株BL21(DE3)‑pET28a‑chiC；(5)体外诱导表达：将重组表达菌株BL21(DE3)‑pET28a‑chiC接入含卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养14h后，按1％的接种量接种到含卡那霉素的LB培养基中，当OD_600nm＝0.6‑0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG，于30℃，100rpm低温诱导6h；(6)几丁质酶chiC的纯化：体外诱导表达结束后于4℃，5,000×g离心5min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体三次，再用PBS缓冲液重悬菌体，之后置于冰上超声破碎三次，每次30s，每次间隔1min，然后于4℃，12,000×g离心20min收集上清液，即为粗蛋白，粗蛋白用Ni2+‑NTA柱进行亲和层析纯化，得到几丁质酶chiC，该几丁质酶具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；所述几丁质酶chiC降解α几丁质和β几丁质生成几丁二糖，适宜的酶解温度为30℃，最适pH值为9.0；测定所述几丁质酶chiC蛋白的几丁质酶活性：1mL反应体系包含5μM的chiC酶，2mg/mL的α‑几丁质、β‑几丁质、胶体几丁质、β‑几丁质纳米须、微晶纤维素和壳聚糖6种底物，在30℃反应24h，而后测还原糖含量；以灭活的酶液作为对照组，设置3个重复；chiC酶降解胶体几丁质的酶活性达1.569±0.017U/mL，依次为α几丁质、β几丁质、壳聚糖、β几丁质纳米须和微晶纤维素，对应的酶活性分别为1.422±0.044U/mL、1.34±0.019U/mL、1.249±0.027U/mL、1.179±0.013U/mL和0.971±0.018U/mL。