[发明专利]一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法及应用

摘要

本发明提供一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法及应用，采用PCR克隆技术从玉米高活性的Mu品系中获得Mu转座子的相关片段，以双元质粒载体pCAMBIA1300为骨架，分别构建新型高效的双元质粒载体pMuE和pMuDR，通过农杆菌介导的遗传转化方法转化玉米鲁元92自交系，从后代中筛选出无选择标记基因的转基因植株。本发明能够提高转基因的转化效率，该载体系统的获得将为今后直接获得无标记基因、生物安全的转化体，尤其可为玉米、水稻等重要粮食作物的无标记基因转化提供可靠、有效的工具，具有重要的理论意义和应用价值。

主权项

一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，包括如下步骤：步骤一：双元质粒载体pMuDR构建：以phMR53质粒为模板，设计引物进行PCR扩增，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳、切胶后纯化回收mudrA基因的全长cDNA片段；用Pst I限制性内切酶对mudrA基因的全长cDNA片段酶切，然后与用Pst I限制性内切酶对pAHC20质粒酶切去除Bar基因的pAHC20(Bar^－)载体片段连接获得pAHC20(Bar^－mudrA⁺)；用EcoR I和Hind III限制性内切酶对质粒pCAMBIA1300和pAHC20(Bar^－mudrA⁺)两者双酶切，前者回收载体部分，后者回收Ubi‑mudrA‑Nos片段，连接构建得双元质粒载体pMuDR；步骤二：双元质粒载体pMuE构建：设计引物进行PCR扩增，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳、切胶后纯化回收Mu1完整片段，用Kpn I分别对回收的Mu1完整片段进行处理和对质粒pCAMBIA1300进行单酶切，然后进行连接，将Mu1转座子片段插入Kpn I位点形成新的携带Mu1转座子的质粒载体pCAMBIA1300(Mu1⁺)；用Hind III和EcoR I限制性内切酶对pAHC20质粒进行双酶切，回收Bar基因表达盒，用BstE II对载体pCAMBIA1300(Mu1⁺)进行单酶切，酶反应后补平粘性末端，然后两者进行连接，将Bar基因表达盒插入Mu1转座子片段内部形成新的双元质粒载体pMuE；步骤三：将质粒载体pMuDR和pMuE分别导入农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化方法转化玉米鲁元92自交系，从后代筛选无选择标记基因的转基因植株。