[发明专利]一种具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法

摘要

本发明公开了一种具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型α‑淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法；包括(1)原核表达体系构建及菌液培养诱导表达；(2)原核表达可溶性蛋白纯化；和/或(3)原核表达包涵体蛋白纯化及蛋白复性。目前，经过多次反复实验证明，采用本发明工艺流程，对此种α‐淀粉酶抑制剂进行工艺生产，得到的蛋白产量高、纯度高，生产工艺简单方便，生产周期短，无需价格昂贵设备，是一种适合于此α‐淀粉酶抑制剂生产纯化的优良生物工艺方法。

主权项

一种具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型α‑淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法，其特征在于包括以下步骤(1)和选自步骤(2)和步骤(3)中的一项或两项：(1)原核表达体系构建及菌液培养诱导表达：将Q9SMJ4蛋白的ORF克隆至原核表达载体，并构建Q9SMJ4蛋白大肠杆菌原核表达体系；培养Q9SMJ4蛋白大肠杆菌原核表达体系，并诱导目的蛋白表达；其中所述的原核表达载体含有His标签蛋白编码基因；(2)原核表达可溶性蛋白纯化：a.每50mL培养菌液收集的菌体用缓冲液1 10mL重悬菌体，并加入170μL 35％的TritonX‑100和100μL 100mM的PMSF；b.将重悬菌液置于冰上，超声破碎直至菌液变得澄清透明，超声条件为超声破碎3s，冷却5s，功率为400瓦特；c.将超声破碎过的菌液12000rpm，4℃离心15min，收集上清，弃沉淀；d.将含有His标签蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速0.5‑1.0mL/min，直至上清液完全流过Ni柱，上样量:柱体积(v/v)比例最大为15:1；e.用8倍柱体积的缓冲液2冲洗Ni柱或直至A280值达到稳定，流速控制为1.0mL/min；f.洗脱His标签表达蛋白采用梯度洗脱方式，每一梯度洗脱体积为4个柱体积，收集各个梯度洗脱蛋白；g.通过SDS‑PAGE电泳检测上一步中各洗脱梯度洗脱蛋白纯度，确定收集成份单一、杂质较少且蛋白分子量与目的蛋白相符合的蛋白洗脱组分；h.将收集的洗脱蛋白液装入截留分子量为3600Da的透析袋中，放入超纯水中透析24h除盐，期间晃动透析袋并更换超纯水；i.将透析结束的透析袋放入40％(w/v)的PEG 6000溶液中浓缩至适当体积，即为原核表达并纯化收集的Q9SMJ4可溶性蛋白溶液；其中,所述的缓冲液1为50mM NaH2PO4、300mM NaCl，pH＝8.0；所述的缓冲液2为50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑，pH＝8.0；步骤f使用的洗脱液为50mM NaH2PO4、300mM NaCl，pH＝8.0，咪唑浓度分别为50、100、150、200、250mM；(3)原核表达包涵体蛋白纯化及蛋白复性：a.每50mL培养菌液收集的菌体用pH＝8.0、0.1M磷酸缓冲液10mL重悬菌体；b.将重悬菌液置于冰上，超声破碎直至菌液变得澄清，超声条件为超声破碎3s，冷却5s，功率为400瓦特；c.将超声破碎过的菌液12000rpm，4℃离心10min，收集沉淀，弃上清；d.用pH＝8.0、0.1M磷酸缓冲液洗涤沉淀一次，12000rpm，4℃离心10min，收集沉淀；e.用10mL溶解液溶解沉淀，在室温下孵育1‑2h，期间不断摇晃溶液，使沉淀溶解完全；f.12000rpm，4℃条件下离心30min，收集上清液，弃沉淀不溶物；g.用8倍柱体积缓冲液3平衡Ni柱，控制流速为0.5‑1.0mL/min；h.将步骤f中收集到的含有His标签蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速0.5‑1.0mL/min，直至上清液完全流过Ni柱，上样体积:柱体积比例最大为15:1；i.用4倍柱体积缓冲液3再次平衡Ni柱，控制流速0.5‑1.0mL/min；j.用2倍柱体积的缓冲液4冲洗Ni柱或直至A280值达到稳定，流速控制为1.0mL/min；k.用6倍柱体积的缓冲液5洗脱包涵体蛋白流速控制为1.0mL/min；l.SDS‑PAGE电泳检测上一步中洗脱蛋白纯度及纯化效果；m.在4℃条件下将洗脱收集到的包涵体蛋白自然复性，向溶液中慢慢加入超纯水，使溶液中脲浓度进行梯度稀释；n.将复性结束的蛋白溶液装入截留分子量为3600Da的透析袋中，放入超纯水中透析24小时除盐，期间晃动透析袋并更换超纯水；将透析结束的透析袋放入40％(w/v)的PEG 6000溶液中浓缩至适当体积，即为原核表达纯化收集并复性的Q9SMJ4包涵体蛋白溶液；其中，所述的溶解液为100mM NaH2PO4、10mM Tris‑HCl、100mM DTT、8M脲，pH＝8.0；所述的缓冲液3为100mM NaH2PO4、10mM Tris‑HCl、8M脲，pH＝8.0；所述的缓冲液4为100mM NaH2PO4、10mM Tris‑HCl、8M脲、10mM咪唑，pH＝8.0；所述的缓冲液5为100mM NaH2PO4、10mM Tris‑HCl、8M脲、200mM咪唑，pH＝8.0；步骤m中脲浓度进行稀释的梯度为8M‑6 M‑4 M‑2 M‑1 M‑0.1M，每一梯度持续时间为1h。