[发明专利]一种用Vero细胞检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素甲醛灭活效果的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用Vero细胞检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素甲醛灭活效果的方法，包括步骤1将产毒多杀性巴氏杆菌菌液制备；步骤2灭活菌液备用；步骤3产毒多杀性巴氏杆菌毒素液制备；步骤4将培养好的单层Vero细胞消化计数后，用含2%胎牛血清MEM培养基将细胞悬液稀释，向多孔实验孔板中每孔加100μl MEM培养基；将菌毒素液，按照等倍稀释的方法加入孔中；每孔再加入100μl Vero细胞悬液，混匀后置36~38℃，CO2培养箱培养七天后观察结果；细胞拉丝病变判为阳性，细菌聚团判为可疑，无病变判为阴性。利用本方法能更准确的检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素是否完全灭活或者最大限度的灭活，从而很好的保证了相关疫苗的安全。

主权项

一种用Vero细胞检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素甲醛灭活效果的方法，其特征在于：包括：步骤1:将产毒多杀性巴氏杆菌接种于脑心浸液培养基，置于36~38℃恒温振荡培养箱，以200r/min培养12~18小时，收获菌液；步骤2:将甲醛溶液按照0.3%的终浓度（v/v)加入步骤1中制备好的菌液中，置36~38℃恒温振荡培养箱，以200r/min作用48小时后，灭活菌液备用；步骤3:取步骤2中制备好的灭活菌液在4℃条件下，以l0000r/min离心30分钟，聚集菌体，用与灭活菌液同体积的无菌PBS漂洗4次后，用灭活菌液1/5体积的无菌PBS悬浮，将灭活菌悬液转移至离心管，将离心管置冰水混合物中放入超声波仪器内室，40%输出功率，每工作4秒，间隔15秒，超声破碎30分钟；在4℃条件下，以l0000r/min离心30分钟收集上清菌毒素液，上清菌毒素液经0.22滤膜过滤，无菌检验合格后，备用；步骤4:将培养好的单层Vero细胞消化计数后，用含2%胎牛血清MEM培养基将细胞悬液稀释至2×105个/ml，向多孔实验孔板中每孔加100µl MEM培养基；将步骤3制备好的上清菌毒素液，按照等倍稀释的方法依次加入实验孔板的孔中；然后，每孔再加入100µl稀释好的Vero细胞悬液，混匀后置36~38℃，CO2培养箱培养七天后观察结果；细胞拉丝病变判为阳性，细菌聚团判为可疑，无病变判为阴性。