[发明专利]一种成年豚鼠心肌分离细胞的培养方法

摘要

本发明公开了一种成年豚鼠心肌分离细胞的培养方法，包括以下步骤：（1）急性细胞分离；（2）铺细胞：取步骤（1）得到的心室肌细胞离心后放入培养基中，用细胞计数器计算出心肌细胞密度，铺在培养皿上的细胞密度应控制小于10⁴个正常杆状细胞/cm⁻²；（3）更换培养液：在细胞铺后4小时之内每隔30min慢慢更换培养液，4小时之后，每3天换一次培养液。该方法使用方便且培养的心肌细胞成活率高并具有极好的稳定性，为心脏病研究及新药研发提供了一个重要手段。

主权项

一种成年豚鼠心肌分离细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）急性细胞分离：（a）将成年豚鼠麻醉后快速取出心脏放置于4 C°含钙液中去除心包，找出主动脉然后挂于灌注装置上开始心脏逆向灌注，先用含钙液灌流2min，然后用无钙EGTA 液灌流5min，再用酶解液循环灌流8‑10min，再用酶洗脱液灌流5min；（b）剪下心室肌组织放入无菌培养皿并切碎，（c）将切碎的心室肌组织加入酶洗脱液中，在37°C下用自动摇晃机进行机械性分离5‑10min得到细胞悬浮液（d）将细胞悬浮液用200目的尼龙纱布过滤，所得滤液中的心室肌细胞准备下一步培养；其中，所述含钙液为：300ml灌流母液中加入CaCl₂至Ca²⁺ 浓度为750μmol/L ；所述无钙EGTA 液为：300ml灌流母液中加入EGTA至EGTA浓度为3.3μmol/L；所述酶解液为：80ml灌流母液中加入CaCl₂、粗胶原酶和蛋白酶，使Ca²⁺ 浓度为100μmol/L、粗胶原酶浓度为1mg/ml、蛋白酶的浓度为0.1 mg/ml；所述酶洗脱液为：220ml灌流母液中加入CaCl₂至Ca²⁺ 浓度为100μmol/L；所述灌流母液用超纯水配制，其中含有：130 mmol/L NaCl，23 mmol/ L 4‑ 羟乙基哌嗪乙磺酸，21 mmol/L 葡萄糖，20 mmol/L 牛磺酸，5 mmol/L 肌酸，5 mmol/L MgCl₂，5 mmol/L 丙酮酸钠，4.5 mmol/L KCl，1 mmol/L NaH₂PO₄，pH 为7.3；（2）铺细胞：取步骤（1）得到的心室肌细胞离心后放入培养基中，用细胞计数器计算出心肌细胞密度，铺在培养皿上的细胞密度应控制小于10⁴个正常杆状细胞/ cm⁻²；（3）更换培养液：在细胞铺后4小时之内每隔30 min慢慢更换培养液，取出死细胞，4小时之后，每3天换一次培养液。