[发明专利]一种应用BLU-V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法

摘要

本发明公开了一种应用BLU‑V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法。根据GenBank已公布Map的（登录号：AF286339）ISMAV2基因组序列，选取该基因的保守序列，设计TaqMan荧光探针及引物。将BLU‑V系统作为光源应用于PMA技术中结合荧光定量PCR技术的优点，成功建立了一种快速检测奶及奶制品中MAP活菌的方法。该方法操作简单，快速且比较精确。

主权项

1.一种应用BLU‑V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法，其特征在于将BLU‑V系统作为光源应用于PMA技术中；所述的将BLU‑V系统作为光源应用于PMA技术判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法包括如下步骤：a取待测样品，液体样品直接离心，固体样品加蒸馏水溶解离心，14500r离心5min；离心完毕后，弃去上清，加入EB Buffer于沉淀中，混匀得菌悬液；b向步骤a的菌液中加单叠氮丙啶，使单叠氮丙啶的终浓度为10μg/mL，充分混匀，并设不加PMA的菌悬液作为对照；将EP管置于避光盒中，避光10min；取出EP管，将其放入BLU‑V系统中，仪器的光强为100，作用20min，使PMA与死菌的DNA双链结合；每隔2min取出EP管在漩涡振荡仪上振荡混悬一次，以增加结合率；c步骤b结束后，取出EP管，14500r离心5min；离心完毕后，弃去上清；最后加入400μL的TE，再次重悬混匀；后续进行常规的DNA提取；d以步骤c中提取的DNA为模板，进行荧光定量PCR检测样品中的目标菌，上下游引物及探针序列分别为上游：5’‑AACGAGGGGACGATGAGG‑3’下游：5’‑CTGTGATGTAACGCGATTCG‑3’探针5’‑FAM‑CACGGCGTTGCTGATGTCCACC‑TAMRA荧光定量PCR反应体系为10×PCR Buffer: 500mM KCl,100mMTris‑cl，pH8.3室温下2.5μL，MgCl2 25mM 1.5μL，dATP,dCTP,dTTP,dGTP各3.2μmol,2.0μL，上下游引物10pmol各1.0μL，TaqDNA酶5U/μL,2.5μL，探针3pmol 1.0μL，模板DNA 2.0μL，ddH2O 11.5μL，总反应体系25.0μL。