[发明专利]草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法及应用

摘要

本发明公开了草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法及应用，该方法为用病原真菌通用、特异性引物对病原菌DNA进行PCR反应，当PCR产物呈现大约500bp单一条带，对PCR产物测序，测序结果在NCBI数据库进行比对，即可明确病样组织中含有引起草莓根腐病不同病原菌。该方法操作简单，耗时少，通量大。通过该方法对草莓苗圃种苗根部病样等进行定性检测，可以有效避免草莓根腐病的传播与发生，保障我国草莓无病种苗生产基地的建设、安全生产。

主权项

草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法，包括以下步骤：步骤1.病原菌的分离采用组织分离法对草莓根部的病原菌进行分离，切取病健交界处的病组织4‑5mm的小块，置于75％乙醇中浸泡5s，接着将病组织移入0.1％升汞溶液中浸泡3‑5min，再将病组织转移到无菌水中漂洗3遍，最后将组织移到PDA培养基上，将培养皿放置25℃培养箱中培养3‑5d，菌落直径1cm即进行DNA提取实验；步骤2.病原菌DNA少量提取1)用灭菌牙签刮取PDA平板上的少量病原菌菌丝，装入2.0ml的离心管中；2)加入500μl Lysis buffer，1颗破碎珠，多样品组织研磨机研磨60‑90s；3)室温静置10min；4)13200rpm，室温离心10min，取上清液400μl转入新离心管中；5)加入800μl无水乙醇，颠倒混匀；‑20℃静置10min沉淀DNA；6)13200rpm，4℃离心5min；7)沉淀用75％乙醇洗涤，空气中干燥后用50μl ddH₂O溶解，上清即为提取的DNA溶液，用于下游PCR模板；步骤3.设计病原真菌通用引物上游引物ITS1：5’‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3’；下游引物ITS4：5’‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3’；步骤4.PCR扩增PCR反应体系为25μL，反应液为：10×buffer2.5μL，dNTP1μL，引物ITS1和ITS4各1μL，Taq酶0.5μL，DNA模板3μL，ddH2O 16μL，PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min，进行35个循环；72℃总延伸10min；在1％的琼脂凝胶上检测PCR结果，当PCR产物呈现500bp条带，即样本中含有草莓根腐病病原菌，将随机挑选样品CY2、JN3、JM2、LW2PCR产物送往生工生物工程上海股份有限公司测序；步骤5.序列分析测序结果与NCBI数据库http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_L OC＝blasthome序列比对，得到明确的草莓根腐病病原菌种类。