[发明专利]简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法

摘要

本发明公开了一种简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法，包括收集猪卵巢、挑选卵母细胞、卵母细胞成熟、供体细胞分离培养、挑选成熟卵母细胞、克隆胚胎构建、克隆胚胎培养、克隆胚胎移植等步骤，将3-D摇床成熟培养产生的卵母细胞孤雌激活后，猪孤雌激活胚胎的囊胚发育率超过70%，达到了国内领先水平，可以完全替代传统的C0₂培养箱成熟方法。本发明对于哺乳动物卵母细胞体外成熟和胚胎培养的优化等提供了具体策略和方法，对于整个哺乳动物的胚胎工程产业化和相关发育生物学研究具有很大的应用价值和借鉴意义。

主权项

一种简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法，其具体操作步骤如下：①收集猪卵巢：从屠宰场收集普通商品猪卵巢,置于 30～37 ℃的0.9%生理盐水中，5 h内运回实验室 ,并用生理盐水冲洗3～5 次；②挑选卵母细胞：用带 12 号针头的 10 ml注射器抽取卵巢表面上直径为 2～6 ml 卵泡的卵母细胞 ,然后在实体显微镜下用胚胎移液器吸取带有2层卵丘细胞以上、胞质均匀的卵母细胞，在洗卵液中洗3 次，再在成熟液中洗 2次；③卵母细胞成熟：将挑选好的卵母细胞放入含有卵母细胞成熟液的离心管中，用3‑D摇床成熟45 h ,培养条件为39 ℃；④供体细胞分离培养：无菌获取成年猪耳部组织样本，并于低温条件下及时运送到实验室；将其剪碎离心洗涤后，加入适量供体细胞培养液，并将组织碎块接种到培养瓶中；待供体细胞爬出并长到70～80%汇合度时，进行传代培养或冷冻保存；⑤挑选成熟卵母细胞：将成熟42～46 h的猪卵母细胞在0.1～0.3 %的透明质酸酶中涡旋震荡，去除卵丘细胞，挑选排出第一极体的成熟卵母细胞，通过盲吸去核法进行去核；⑥克隆胚胎构建：吸取中等大小、圆形、细胞膜折光度较好的供体细胞注射到透明带下方，并轻点透明带使供体细胞与去核的卵母细胞细胞膜良好接触，形成重构卵；⑦克隆胚胎培养：将重构卵在洗涤液中洗涤3遍后，分批移到融合槽的融合液中进行融合；将融合过的重构胚，分批移入激活液中激活3h，然后再移入胚胎培养液中，在39℃的培养箱中培养直至移植；⑧克隆胚胎移植：选用自然发情或诱导发情的母猪作为受体母猪，发情当天至第2天手术进行克隆胚胎移植，手术前停喂饲料12h；将培养好的克隆胚胎置入37℃的便携式培养箱中带入猪场手术室；⑨克隆胚胎移植后28～30天通过B超检查受体母猪怀孕情况。