[发明专利]除皱短肽及其制备方法

摘要

本发明涉及基因工程领域重组蛋白的制备方法，具体是一种新型除皱短肽及制备方法。本发明公开了一种除皱短肽命名为E14，由14个氨基酸所组成；同时公开了一种利用大肠杆菌发酵的工艺，可以实现工业化大规模的制备重组E14（简称rE14）。本发明利用多种生物学手段检测，证实rE14生产工艺简单，成本低廉，纯度好，稳定性高，能够让抗衰老皮肤营养产品走近百姓的日常生活，具有广阔的市场应用前景。

主权项

1.一种除皱短肽rE14的制备方法，其特征在于：所述除皱短肽rE14的氨基酸序列为：Gly‑Pro‑Glu‑Glu‑ Met‑Gln‑Arg‑Arg‑Leu‑Glu‑Val‑Leu‑Phe‑Gln，表示利用大肠杆菌发酵的工艺重组表达的除皱短肽，其制备方法包括如下步骤：（1）、大肠杆菌基因工程菌的构建：1.1、设计Leu‑Glu‑Val‑Leu‑Phe‑Gln‑Gly‑Pro‑Glu‑Glu‑Met‑Gln‑Arg‑Arg的氨基酸序列为基本重复单元pL14构建蛋白序列pL14‑n，其中n为1‑100的任意数值；1.2、合成如上所示蛋白序列相对应的核苷酸序列L14‑n，即（ctggaggtgctgtttcagggtccggaagagatgcagcgtcgc）n；1.3、将核苷酸序列L14‑n克隆进入表达载体，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；（2）大肠杆菌基因工程菌的发酵培养：2.1、挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，至于LB培养基中35～38℃培养过夜；2.2、将菌液接种放大培养，35～38℃培养2.5～3小时，加入IPTG进行诱导，15～18℃继续培养18～22小时，此时表达出的蛋白为GST‑pL14‑n，离心收集菌体；（3）重组除皱短肽rE14的纯化：3.1、用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；3.2、在谷胱甘肽亲和柱上加入Prescission Protease蛋白酶，利用谷胱甘肽亲和柱从上清液中纯化得到除皱短肽rE14。