[发明专利]一种产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的单菌落琼脂块筛选方法

摘要

本发明公开了利用单菌落琼脂块筛选产反式‑4‑羟脯氨酸重组大肠杆菌的方法。该方法采用重组大肠杆菌为出发菌株，经诱变后，涂布到所设计的平板上，培养至有大小合适的菌落长出；用不锈钢打孔器将菌落依次打成圆形的琼脂块，用镊子夹取琼脂块放置于可吸附性材料上，待其干燥；加试剂①不同氨基酸显示不同颜色；点加试剂②后只有L‑羟脯氨酸颜色变为玫红色，其他氨基酸褪色。据显色圈与菌落直径之比，以及显色圈深浅，筛选产反式‑4‑羟脯氨酸的菌株。本发明的优点是提供了一种以固体培养方式，利用单菌落琼脂块法方便快速的筛选出高产菌株，使筛选具有一定的定向性，大大减少了筛选菌株工作量。

主权项

1.一种快速筛选产反式‑4‑羟脯氨酸重组大肠杆菌的方法，包括如下步骤：(1)诱变后的重组大肠杆菌，稀释涂布于平板培养基，培养至大小合适的单菌落长出；所述培养基成分为：甘油20g/L，胰蛋白胨8.81g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸铵5g/L，NaCl2g/L，Mg2+0.02％，Ca2+0.2％，L‑脯氨酸8.98g/L，Fe2+2mmoL/L，琼脂1.5％；(2)用打孔器将单菌落取出置于滤纸上，以使菌落产生的反式‑4‑羟脯氨酸渗透到滤纸上；(3)用移液枪分别点加试剂①和试剂②，使其显色；试剂①为吲哚醌溶于乙醇和冰醋酸的溶液；②为对二氨基苯甲醛溶于丙酮和浓盐酸的溶液；(4)挑选出产反式‑4‑羟脯氨酸重组大肠杆菌菌株；标准色板制备：①制备L‑脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/L、0.10g/L、0.15g/L、0.20g/L、0.25g/L、0.30g/L、0.35g/L、0.40g/L、0.45g/L、0.50g/L、0.55g/L、0.60g/L；②制备L‑羟脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/L、0.10g/L、0.15g/L、0.20g/L、0.25g/L、0.30g/L、0.35g/L、0.40g/L、0.45g/L、0.50g/L、0.55g/L、0.60g/L；③制备L‑脯氨酸和L‑羟脯氨酸的不同浓度梯(1：1)混合液：二者浓度分别为0g/L、0.10g/L、0.15g/L、0.20g/L、0.25g/L、0.30g/L、0.35g/L、0.40g/L、0.45g/L、0.50g/L、0.55g/L、0.60g/L；④将以上制备的三种溶液，每个浓度分别取5μL点加到三张滤纸上，间隔为3cm；；⑤点加5μL试剂①后，热风吹干；⑥点加5μL试剂②后，热风吹干；将步骤(3)的显色结果与标准色板进行比对，显色圈与菌落直径之比越大，以及显色圈越深，L‑羟脯氨酸产量越高。