[发明专利]基于DNA标签-PCR快速检测TGEV早期感染的方法

摘要

本发明公开了一种基于DNA标签-PCR快速检测TGEV早期感染的方法，该方法通过特异性核酸偶联的磁性微粒从血清中快速高效地富集病毒，并在此基础上进一步通过特异性DNA标签偶联的金纳米颗粒将核酸样本信号放大，使核酸样本达到PCR检测所需的核酸模板浓度，具有省时、省力、成本低等特点；此外，本发明的检测方法因不需要经过提取RNA再反转录为cDNA，所以操作简便，成本低，易于产业化和大规模应用。

主权项

一种基于DNA标签‑PCR快速检测TGEV早期感染的方法，其特征在于，包括以下步骤：Step1、制备TGEV特异性探针标记的磁性微粒MMP，所述TGEV特异性探针序列为：5’NH2‑T15CAAATATTTCGTTTAGTTCGAGTTGGTGTCCG；Step2、制备TGEV特异性信号探针标记的纳米金颗粒AuNPs，所述特异性信号探针序列为：5’SH‑T15CGAATAGGAAGACTAGGCACGTTGACTTACTTGTACAGCTCG；Step3、TGEV探针标记的MMP和AuNP与TGEV病毒RNA的杂交反应及目标DNA标签的洗脱：3a、取500μl TGEV血清样本和100μl裂解液至1.5ml离心管中，煮沸15min使病毒RNA释放，4℃、12000rpm离心5min，取上清，所述裂解液：10mmol/L Tris‑HC1，1mmol/L EDTA，15mmol/L NaCl，0.5％SDS，pH 8.0；3b、在上述裂解上清中加入100μl、pH4.8的NaAc，再加入等体积异丙醇混匀，沉淀30min，12000rpm离心5min，去上清，加500μl75％乙醇洗涤2次，10μl TE缓冲液重悬病毒核酸，所述TE缓冲液：1M Tris buffer pH 8.0，1mM EDTA；3c、取2μl标记后的磁性微粒MMP和10μl病毒核酸，加入17μl杂交缓冲液混匀，40℃杂交30min，杂交完毕后加入2μl标记后的纳米金颗粒AuNPs，混匀后50℃杂交40min，获得AuNP‑MMP复合物，所述杂交缓冲液：5×SSC，0.1％Tween‑20，0.2％SDS；3d、每次取1ml TE缓冲液，洗2‑3次，去除残留的杂交缓冲液、未结合的探针和DNA标签；3e、用100μl新配置的DTT洗脱液与AuNP‑MMP复合物在室温下作用10min，磁分离3min后取上清液，所述DTT洗脱液：0.5mol/L DTT，10mM Tris‑HCl，1mM EDTA，pH 7.5；3f、加入1/10体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，沉淀30min；3g、4℃、12000rpm离心10min，弃上清，加入75％乙醇洗涤两次；3h、4℃、12000rpm离心10min，弃上清，自然风干，加入3μl的H₂O溶解DNA标签；Step4、PCR检测与TGEV特异结合的DNA标签：4a、以pEGFP‑N1为模板，上游引物F：ATAGCGGTTTGACTCACGGG，下游引物R：CCCTTTGACGTTGGAGTCCA，采用50μl体系：10×buffer 5μl，dNTP 4μl，上游引物1μl，下游引物1μl，Taq酶0.5μl，模板2μl，ddH₂O 36.5μl，反应程序如下：94℃预变性4min；94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸105s，共30个循环；72℃延伸10min；将pEGFP‑N1扩增产物切胶回收，并浸泡到TE中4℃保存；4b、以pEGFP‑N1扩增产物和DNA标签为模板，上游引物：AGCAGAAGAACGGCATCAAG，下游引物：GCCATCTTGGCCAGATCCT，采用25μl体系：10×buffer 2.5μl，dNTP2μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，Taq酶0.2μl，pEGFP‑N1扩增产物0.5μl，纯化的DNA标签0.5μl，ddH₂O 18.3μl，反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性40s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min；取25μl PCR扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳并使用凝胶成像仪观察和记录结果。