[发明专利]一种鸡生殖新月来源PGCs的分离培养方法有效
申请号: | 201510262185.8 | 申请日: | 2015-05-21 |
公开(公告)号: | CN104911144B | 公开(公告)日: | 2018-08-24 |
发明(设计)人: | 王丙云;陈志胜;陈胜锋;计慧琴;李东升;冼琼珍 | 申请(专利权)人: | 佛山科学技术学院 |
主分类号: | C12N5/0735 | 分类号: | C12N5/0735 |
代理公司: | 广州新诺专利商标事务所有限公司 44100 | 代理人: | 许英伟 |
地址: | 528000 广*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | 本发明所述一种鸡生殖新月来源PGCs的分离培养方法,包括以下步骤:(1)分离方法是通过贴滤膜法从种蛋中取出无卵黄污染的干净鸡胚,然后从鸡胚中获取生殖新月组织;(2)用胰酶将生殖新月组织消化成单细胞,然后对单细胞中的PGCs进行纯化;(3)将纯化后PGCs置入含有BRL‑3A细胞饲养层和PGCs完全培养液的培养体系中培养。本发明中的PGCs来源于鸡胚生殖新月区,5‑8HH期鸡胚生殖新月区的PGCs含量较高,具有更好增殖活力和维持高水平的多能性,贴滤膜法分离鸡胚胚盘,操作简单,重复性好,从种蛋中分离出无卵黄污染的干净鸡胚,获得较为纯净的PGCs。分离培养的PGCs可大量增殖,用于后续实验操作。 | ||
搜索关键词: | 一种 生殖 新月 来源 pgcs 分离 培养 方法 | ||
【主权项】:
1.一种鸡生殖新月来源PGCs的分离培养方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)分离方法是通过贴滤膜法从种蛋中取出无卵黄污染的干净鸡胚,然后在解剖镜下从鸡胚中获取生殖新月组织;(2)用胰酶将生殖新月组织消化成单细胞,然后对单细胞中的PGCs进行纯化;(3)将纯化后PGCs置入含有BRL‑3A细胞饲养层和PGCs完全培养液的培养体系中培养;步骤(1)包括以下步骤:a)新鲜种蛋孵化到5‑8HH期,无菌条件下小心打开蛋壳,将鸡蛋置于无菌培养皿中,分开蛋清和蛋黄,用眼科剪剪破胚盘上部的浓蛋清,将蛋清刮除干净,露出干燥的卵黄膜;b)取一片直径25mm的微孔滤膜贴于胚盘上部的卵黄膜,按压,使滤膜和卵黄膜紧紧粘附在一起,用镊子夹住滤膜的边缘,用眼科剪小心的沿着滤膜剪开卵黄膜,剪取胚盘,提起滤膜离开卵黄;c)将附着在滤膜上的胚胎垂直的浸入PBS中,将胚胎放于腹侧面,旋转滤纸,除掉绝大部分附着在胚盘上的蛋黄;需要准备3~5个装有PBS的培养皿,除尽蛋黄,胚盘在使用PBS洗涤的时候,整个的胚盘会从滤膜上脱落下来,和卵黄膜分开;d)将分离的胚盘置于解剖镜下,找到生殖新月区域,用镊子剥离生殖新月组织,将周围的其他组织切除,得到的生殖新月组织收集在无菌的Ep管中;所述BRL‑3A细胞饲养层的制备包括以下步骤:a)将冻存的BRL‑3A细胞在已预热至37℃的水浴锅中迅速解冻,逐滴加入培养基稀释至4倍;b)1 000rpm离心5min,弃上清,用含10%血清的配制的培养基重悬细胞,转移至细胞培养皿中,37℃,5%CO2,饱和湿度下培养;c)选择生长状况良好、80%‑90%汇合的细胞,去掉培养基,用PBS洗涤后加入含10μg/mL丝裂霉素‑C的细胞培养基,37℃孵育2h;d)去掉培养基,用PBS洗涤BRL‑3A细胞4‑6次,以确保完全去除丝裂霉素‑C;e)用胰酶消化,制备单细胞悬液,调整细胞密度为5×105个/mL,接种于培养板中,置37℃,5%CO2,培养箱中培养,24h后使用;f)密切观察细胞生长情况,若发现细胞过稀则补加丝裂霉素‑C处理过的细胞,以保证细胞铺成单层,能连成一片而没有间隙;g)将制备好的饲养层放置在培养箱中备用,使用前去除培养液且用PBS洗5次,换为干细胞培养液;制备好的饲养层在5天内使用;所述PGCs完全培养液的配方如下:总和100mL,
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