[发明专利]鲫鱼鲤疱疹病毒2型特异性PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明属于生殖技术领域，具体涉及一种公开了鲫鱼鲤疱疹病毒2型特异性PCR检测试剂盒及检测方法。本发明所述的鲫鱼鲤疱疹病毒2型的PCR快速检测试剂盒，包括2×反应混合缓冲液1.0mL；优选设计的上、下游引物；Taq DNA聚合酶；阳性对照液；阴性对照液；ddH2O。本发明克服了现有鲤疱疹病毒2型检测方法的不足，提供一种新型PCR快速检测试剂盒及检测方法。本发明对鲫鱼鲤疱疹病毒2型进行临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测鲫鱼鲤疱疹病毒2型提供了便利条件。

主权项

鲫鱼鲤疱疹病毒2型的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(1)2×反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：(2)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的鲤疱疹病毒2型的基因序列，设计一对特异性检测引物，上游引物C‑F：5’‑CGCAGCGGGATCATCCCAATC‑3’，下游引物C‑R：5’‑CGATGTGTATTTCATATAGTG‑3’，浓度为10μM；(3)Taq酶               5U/μL；(4)灭菌的ddH2O         1.0mL；(5)阳性对照液：鲫鱼鲤疱疹病毒2型基因组DNA；(6)阴性对照液：健康鲫鱼基因组DNA；采用试剂盒检测鲫鱼鲤疱疹病毒2型的方法为：(1)鲫鱼鲤疱疹病毒2型DNA的提取：取鳃、脾脏、肾脏组织，加入灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于‑20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris‑饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用ddH2O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于‑70℃保存备用；(2)PCR反应体系：采用PCR反应体系，在PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液，上游引物、下游引物，Taq DNA聚合酶，DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；(3)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取产物在含溴化乙锭0.5μg/mL的1.5％琼脂糖凝胶上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；(5)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在526bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为鲤疱疹病毒2型阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的鲤疱疹病毒2型。