[发明专利]一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法

摘要

本发明公开了一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，以地衣芽孢杆菌为生产菌株，通过菌株活化、种子液培养、发酵罐深层液体通风发酵、酶制剂制备的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶制剂，得到固体阿魏酸酯酶酶制剂稳定性好、适用范围广，制备工艺简单，酶活高，制备得到的酶制剂酶活力可达378U/g，总回收率达到了81.5%，具有极好的工业化应用前景。

主权项

一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，一级种子的制备：首先将液体种子培养基在三角瓶中装液30mL‑50mL，调节pH至7.0，经121℃灭菌20min，冷却后，按照体积比为4‑6v/v%的接种量接种菌株，于40‑45℃的摇床上培养18‑24h，得到一级种子液；步骤2，二级种子的制备：按照6‑10v/v%的接种量将培养好的一级种子液接种到二级种子培养基中，32‑37℃培养18‑24h，得到二级种子液；步骤3，自动发酵罐发酵工艺：将发酵培养基装入发酵罐中，12l℃下灭菌25 min，将步骤2所得二级种子液倒入罐体，开始发酵培养，发酵罐罐压0.05Mpa，发酵开始到发酵24h，发酵温度控制在40‑45℃，通气量为3L/mm，搅拌转速150r/min，发酵培养基初始pH7.0；发酵24‑48h，发酵温度提高到45‑50℃，通气量增加到4L/mm，搅拌转速维持150r/min，发酵48h时，向发酵液中添加发酵促进剂15mL，发酵至60h时，向发酵液中添加营养液200mL，发酵48h‑72h，发酵温度降为35‑40℃，通风量降至3L/mm，发酵至72h，发酵罐放出一半体积发酵液，然后添加补料培养基和发酵促进剂，35‑40℃条件下继续发酵36h后终止发酵；步骤4，酶制剂的制备：将步骤3所得发酵液在4℃、8000r/min、离心20min，所得上清进行超滤浓缩，向浓缩后的粗酶液中添加2‑3wt%可溶性淀粉，搅拌，再添加8‑12wt%麦芽糊精，搅拌均匀后喷雾干燥，即得阿魏酸酯酶制剂；所得阿魏酸酯酶制剂酶活力为378U/g，35℃‑65℃的酶活在80%以上；所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DBM12，已于2014年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No.8672。