[发明专利]一种靶向SRSF6的慢病毒干扰载体的构建及其在结直肠癌治疗中的应用

摘要

本发明公开了抑制SRSF6基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法，所述的shRNA序列为F:5'‐CCGGCGTACAGAATACAGGC TTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG‐3'，R:5'‐AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTAT TCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG‐3'；所述慢病毒表达载体是将上述的shRNA插入载体质粒PLKO.1中,构建PLKO.1‐SRSF6‐shRNA；载体测序验证正确后将其和包装质粒PSPAX2和PMD2.G中转染HEK293T细胞获得慢病毒悬液；用此悬液去感染结直肠癌细胞,然后用嘌呤霉素筛选验证病毒包装是否成功；Western Blot验证其能明显降低SRSF6的表达水平；并能显著降低结直肠癌细胞的增殖能力和迁移侵袭能力；其中SRSF6对肿瘤细胞迁移侵袭能力的作用的研究尚数首次。

主权项

1.一种慢病毒质粒载体，其特征是该载体含有人的SRSF6的基因干扰片段,其特征是该载体为PLKO.1‐SRSF6‐shRNA,该载体中包含的shRNA序列是F:5'‐CCGGCGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG‐3'R:5'‐AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG‐3'；所述的载体构建方法如下：合成上述shRNA序列对应的DNA寡核苷酸序列，a)取等量100mmol/L的DNA寡核苷酸单链片段混合，在退火缓冲液中加热到95℃，5分钟，缓慢降至室温，得到插入片段；b)用AgeI、EcoR I双酶切PLKO.1表达载体3h后，琼脂糖凝胶电泳切胶回收载体骨架，T4连接酶将插入片段和载体骨架连接。