[发明专利]无载体固定化米根霉脂肪酶及其制备方法和生产生物柴油的应用

摘要

本发明提供了一种无载体固定化米根霉脂肪酶及其制备方法和应用。本发明的制备方法包括以下步骤：1)将蛋白交联助剂加入含米根霉脂肪酶的缓冲液中以形成第一溶液，所述蛋白交联助剂为血清白蛋白；2)向第一溶液中加入乙二醇二甲醚以使米根霉脂肪酶进行沉淀，静置后得到含米根霉脂肪酶的第二溶液；3)向的第二溶液加入交联剂以形成混合溶液，然后将该混合溶液孵育，其中，所述交联剂选自乙酸酐、甲醛和戊二醛；4)将步骤3)孵育后的混合溶液进行沉淀以得到交联酶聚体。本发明的无载体固定化米根霉脂肪酶催化油脂转酯化反应较强，重复使用多次后仍保持较强活性。 1

主权项

1.一种无载体固定化米根霉脂肪酶在制备生物柴油中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)将蛋白交联助剂加入含米根霉脂肪酶的缓冲液中以形成第一溶液，所述蛋白交联助剂为血清白蛋白；其中，每毫升缓冲液中含有的米根霉脂肪酶为30～70mg，所述米根霉脂肪酶与所述蛋白交联助剂的重量比为5～20:1；

2)向步骤1)得到的第一溶液中加入乙二醇二甲醚以使米根霉脂肪酶进行沉淀，静置后得到含米根霉脂肪酶沉淀的第二溶液，其中所述乙二醇二甲醚的加入体积与步骤1)中所述缓冲液的体积的比值为1～3:1；

3)向步骤2)制得的第二溶液加入交联剂以形成混合溶液，然后将该混合溶液在36～38℃孵育，其中，所述交联剂选自乙酸酐、甲醛和戊二醛；

4)将步骤3)孵育后的混合溶液进行沉淀以得到交联酶聚体，即为无载体固定化米根霉脂肪酶；

5)以油脂和甲醇为制备生物柴油的原料，所述油脂和甲醇在所述无载体固定化米根霉脂肪酶催化作用下发生转酯化反应而生成生物柴油，其中催化作用的温度为45℃，油脂和甲醇的醇油摩尔比为2～5:1，所述无载体固定化米根霉脂肪酶与所述油脂的质量比为0.3～3:1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1)中，所述米根霉脂肪酶为米根霉脂肪酶基因转化表达培养液的冻干粉，所述米根霉脂肪酶转化表达培养液通过将米根霉脂肪酶基因转化到表达载体上培养表达而得。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤3)中，所述交联剂以20～60％(v/v)的交联剂水溶液加入，所述交联剂的终浓度为15～40mM。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤4)中，沉淀得到交联酶聚体的方法为：加入丙酮沉淀，离心除去上清液，再用丙酮洗沉淀而得。