[发明专利]一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法

摘要

本发明公开了一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法。该方法包括(1)使植物中表达一种融合蛋白，以获得对待测蛋白进行单色荧光标记的转基因植物材料；(2)使用可变角全内反射荧光显微镜对转基因植物材料进行观察，获得时间序列图像；(3)利用单颗粒追踪技术对时间序列图像中的荧光点进行识别和追踪，得到荧光点随着时间的轨迹，进而计算荧光点随时间的平均平方位移；(4)利用Origin软件将荧光点随时间的平均平方位移进行拟合，得到对应的常数，计算出荧光点的运动范围。利用本方法测算活体细胞中膜蛋白侧向受限面积的方法简单，重复性好，可以计算出蛋白的个体信息，也可以计算群体平均信息。

主权项

一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法，包括以下步骤：(1)将待测细胞膜蛋白的编码基因与荧光标记蛋白的编码基因进行融合，得到融合基因，将所述融合基因导入受体植物，获得转基因植物；所述转基因植物表达所述融合基因编码的融合蛋白，从而在所述转基因植物中实现对所述待测细胞膜蛋白的单色荧光标记；(2)使用可变角全内反射荧光显微镜对所述转基因植物的活体材料进行观察，获得时间序列图像；所述时间序列图像为检测被所述荧光标记蛋白进行了单色荧光标记的所述待测细胞膜蛋白时，在可变角全内反射荧光显微镜下连续拍摄的图像；(3)利用单颗粒追踪技术对所述时间序列图像中的荧光点进行识别和追踪，得到荧光点随着时间的轨迹，进而计算荧光点随时间的平均平方位移；(4)利用Origin软件将步骤(3)所得的荧光点随时间的平均平方位移进行拟合，拟合的方程为如下式I：y＝A1‑A2e‑kx   式I拟合时，以所述平均平方位移作为y值，以所述时间为x值，通过拟合得到常数A1的值；将所述A1的值代入如下式II，计算获得L2的值：L2＝3A1   式II式II中，L2为荧光点在细胞膜上的运动范围，即为所述待测细胞膜蛋白的侧向受限面积；步骤(1)中，所述荧光标记蛋白为绿色荧光蛋白GFP；步骤(1)中，所述待测细胞膜蛋白为拟南芥向光素phot1；步骤(2)中，使用所述可变角全内反射荧光显微镜对所述转基因植物的活体材料进行观察的过程中，采用的激发波长为473nm或488nm，曝光时间为100ms或200ms，EMCCD增益值为345，连续拍摄图像50‑200帧；步骤(3)中，所述计算荧光点随时间的平均平方位移时，所选取的荧光点为在所述时间序列图像中存在14帧以上的荧光点。