[发明专利]一种葛花降糖活性的定量检测方法

摘要

本发明涉及葛花降糖活性的定量检测方法，可有效解决对葛花降糖活性进行定量检测问题，方法是，包括以下步骤：制备葛花供试药物、配制检测用溶液、制备对照品溶液、测定葛花对α‑葡萄糖苷酶活性抑制率、效价测定与计算，将葛花供试药物的剂量调整到0.17mg•mL‑1~0.68mg•mL‑1，对照品的剂量调整为0.0025mg•mL‑1~0.0100mg•mL‑1，方可进行效价测定，对照品的约定效价值为100U•mg‑1，并根据预实验进行葛花的效价估计，本发明操作简单、快捷，效果好，费用低，基于葛花对α‑葡萄糖苷酶活性的抑制，对葛花样品的效价值进行测定及质量控制评价，具有良好的经济和社会效益。

主权项

1.一种葛花降糖活性的定量检测评价方法，其特征在于，包括以下步骤：1）葛花供试药物的制备：将葛花药材净选，粉碎，加入葛花重量8~12倍的双蒸水浸泡25~35分钟，超声提取15~25分钟，抽滤，得葛花水提物母液，母液质量浓度为0.1g/mL，即为葛花供试药物，密封，闭光4℃保存；2）检测用溶液的配制：（1）制备PBS磷酸缓冲液：将2.0‑2.5g K2HPO4溶解在100mL双蒸水中，制成K2HPO4母液；称取3.2‑3.6g KH2PO4溶解在100mL双蒸水中，制成KH2PO4母液；取K2HPO4母液30‑31ml、KH2PO4母液29‑31ml，混匀，得PBS磷酸缓冲液；（2）制备α‑葡萄糖苷酶溶液：将30U/mg的α‑葡萄糖苷酶冻干粉9‑11mg溶于28‑32ml的PBS磷酸缓冲液中，再加入55‑65mg小牛血清白蛋白，混匀成α‑葡萄糖苷酶溶液，4℃保存；（3）制备PNPG溶液：将85‑95mg PNPG溶于28‑32ml双蒸水中，得PNPG溶液；（4）制备Na2CO3溶液：将10‑11g无水Na2CO3溶于90‑110ml双蒸水中，得Na2CO3溶液；3）制备对照品溶液：取对照品40~60mg，溶于0.5~1.5ml双蒸水中，离心，取上清，即得对照品溶液；所述的对照品为阿卡波糖；4）测定葛花对α‑葡萄糖苷酶活性抑制率：在样品管中加入葛花供试药物0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；在空白管中加入PBS磷酸缓冲液0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；在背景管中加入PBS磷酸缓冲液0.3~0.4ml、对照品溶液0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；然后将上述溶液在35~40℃保温8~12min，向空白管和样品管中分别加入α‑葡萄糖苷酶0.2~0.3ml，35~40℃保温 18~22min；向空白管、样品管和背景管中加入Na2CO3溶液0.4~0.6ml，静置4~6min，从上述管中分别取180~220μl 溶液置于96孔板中，在波长400nm处用酶标仪分别测定各孔板中溶液的吸光度OD值，每管做3个重复，取平均值计算，并将得到的吸光度OD值代入以下公式计算，得葛花对α‑葡萄糖苷酶活性抑制率：酶活性抑制率=[OD空白组‑(OD样品组‑OD背景组)]/OD空白组×100%；5）效价测定与计算：根据预实验与待测样品葛花的效价估计，对待测样品与对照品阿卡波糖的加样量进行调整，调整葛花在0.17mg•mL‑1～0.68mg•mL‑1剂量范围内，阿卡波糖在0.0025mg•mL‑1～0.0100mg•mL‑1剂量范围内，当待测样品与工作对照品在线性范围内反应曲线呈良好的平行关系，通过可靠性检验，即直线回归P < 0.01, 偏离平行、二次曲线和反向二次曲线P>0.05，平均可信限率 FL%在15%以内，将葛花供试药物的剂量、对照品的剂量、葛花对α‑葡萄糖苷酶活性抑制率、对照品的约定效价值、待测样品的估计效价值分别输入中国药典生物检定统计程序BS2000进行计算，即得葛花样品的效价值，实现对葛花质量的评价。