[发明专利]一种制备成熟红细胞的方法

摘要

本发明公开了一种制备成熟红细胞的方法。本发明利用同源性脐带血和胎盘源血内的干细胞在体外用刺激因子使干细胞定向红细胞扩增数十万倍，扩增后的干细胞和红细胞干/祖细胞在体外用刺激因子并和间充质干细胞共同培养和继续扩增，形成成熟的红细胞，其数量可以达到每个胎盘生成20到50个单位，每个单位1012个红细胞，这些细胞具有正常红细胞的功能，可以用于临床用血。本发明为体外大规模产业化生产用于临床的成熟红细胞提供了新方法。

主权项

一种制备成熟红细胞的方法，其特征在于包含以下步骤：（1）提取并纯化来自胎盘源血的单个核细胞，或提取纯化来自于胎盘源血的造血干细胞CD34+CD38+、CD34+CD38‑、造血前体干细胞CD133+CD34+、早期造血前体干细胞CD133+CD34‑或红系干／祖细胞CD34＋CD72＋中的一种或多种；所述的胎盘源血通过以下方法获得：在无菌的环境中打开胎盘，采用无菌生理盐水、磷酸缓冲液、DMEM或1640培养液冲洗胎盘，一直到胎盘外的剩余血都冲洗完毕，在脐静脉靠近胎盘组织内，温度20‑40℃，将导管插入到胎盘源血管内，然后用无菌胶布在脐静脉和导管处固定，采用同样的方法，用两根导管分别插入脐动脉内，并固定，然后这些导管外接一个输液袋，来清洗胎盘24‑36个小时，在此过程中，不断挤压胎盘，使胎盘内的液体不断流到收集瓶中，收集瓶中的液体体积在300‑2000毫升之间，清洗液为生理盐水，磷酸盐缓冲液或DMEM‑1640培养液，含有50‑100单位/mL的青霉素或50‑100微克/ml的链霉素，以及1‑10单位/ml的肝素，导出流速为每分钟10‑50毫升，挤压胎盘速度在开始较慢而后加快，当流出液不再发红，或细胞数低于100/毫升时，此时收集的液体为胎盘源血，里面的细胞为胎盘源血细胞；（2）从纯化的单个核细胞或纯化的CD34+CD38+、CD34+CD38‑、CD133+细胞、红系干／祖细胞CD34＋CD72＋中的一种或多种中扩增干细胞：取 1x106/ml的单个核细胞置入培养瓶，所用的培养液为无血清培养液SFEM并和以下细胞因子共同培养细胞:1‑10×10‑6mol/L糖皮质激素，50‑200ng/ml SCF，50‑200ng/ml Flt3‑L，10‑100ng/ml BMP4，10‑100ng/ml IL‑3，10‑100ng/ml IL‑11和1‑10单位/ml EPO，每3‑5天取细胞离心，更换新培养液，在换2‑5次培养液后收集细胞用于下一步培养；（3）细胞定向培养：取收集的上一步培养的细胞，离心1000rpm，去上清液，换用新的无血清SFEM培养液，并和以下细胞因子共同培养细胞：1‑10×10‑6mol/L糖皮质激素，50‑200ng/ml SCF，10‑100ng/ml BMP4 ，10‑100ng/ml IL‑3，10‑100ng IL‑11，50‑200ng/ml IGF‑1和2‑100单位/ml的EPO,每2‑5天换新培养液，在换2‑5次培养液后，获得有核红细胞，收集细胞用于下一步培养；（4）取收集的上一步获得的有核细胞，将其转移到间充质干细胞铺底的培养瓶内培养3~7天，其中所用的培养液为含2‑10单位/mL EPO的无血清培养液SFEM，或者含2‑10单位/mL EPO的加20％间充质干细胞滋养液的无血清培养液SFEM；（5）取上一步培养的细胞在换液时使用不加任何细胞因子的培养液，还在间充质干细胞的环境下培养，此时扩增生成的红细胞，即为无核成熟的红细胞；其中所使用的培养液选自无血清培养液SFEM，或者加20％间充质干细胞滋养液的无血清培养液SFEM。