[发明专利]一种低毒的Kdo2‑单磷酸类脂A的制备及其应用

摘要

本发明公开了一种新型低毒的Kdo2‑类脂A的制备及其应用，属于生物工程领域。本发明改造大肠杆菌，合成了一种具有特殊结构、低毒的Kdo2‑单磷酸类脂A，这种Kdo2‑类脂A不含外核心多糖长链、仅由两个2‑酮‑3‑脱氧辛酸、六条脂肪酸链和C4位单磷酸构成。该Kdo2‑类脂A，便于分离提取和检测，且保持了类脂A部分的生物免疫活性，较野生型W3110的LPS也有明显的减毒作用，是极具发展潜力的疫苗佐剂。同时，本发明提供的提取和纯化该Kdo2‑类脂A的方法，标准且步骤简单明了，易于操作。

主权项

一种生产低毒Kdo2‑单磷酸类脂A的方法，其特征在于，应用产新型低毒的Kdo2‑单磷酸类脂A的大肠杆菌基因工程菌进行生产，包括三个主要步骤，(1)摇瓶发酵培养菌体，(2)收集菌体，Bligh‑Dyer混合体系提取分离减毒Kdo2‑类脂，(3)DEAE纤维柱纯化Kdo2‑类脂；所述基因工程菌的基因型为E.coli W3110△waaCF△lacIlacZ::FnlpxE；所述低毒的Kdo2‑单磷酸类脂A化学式为C110H201N2O36P，结构包含2个α‑酮基‑3‑脱氧‑D‑甘露辛酸、2个氨基葡萄糖、1个磷酸基团和6条脂肪酸链，是以β‑(1’‑6)连接的D‑葡萄糖胺二糖为骨架，6’位连接二α‑酮基‑3‑脱氧‑D‑甘露辛酸、4’位被磷酸化、3’位连接(R)‑3‑(十四烷氧基)十四烷基、2’位氨基连接(R)‑3‑(十二烷氧基)十四烷基、3位和2位氨基分别连接十四烷氧基而构成；其结构式如式1所示，所述的基因工程菌的构建方法包括如下步骤：1)将人工构建的lacI敲除片段转化入E.coli W3110/pKD46感受态细胞中，获得突变株E.coli W3110lacI::Pkan，通过Cre酶介导的loxP位点特异性重组去除卡那霉素抗性基因；2)FnlpxE片段电转入步骤1)制备的E.coli W3110△lacI/pKD46感受态细胞中，获得重组菌，其基因型为E.coli W3110△lacIlacZ::FnlpxE‑Fkan，通过FLP酶介导的FRT位点的特异性重组分别去除其中的卡那霉素抗性基因，构建成中间菌株HW001；3)在HW001的基础上将人工构建的waaCF敲除片段转化入HW001/pKD46感受态细胞中，获得重组菌E.coli HW001waaCF:Pkan，再次通过FLP酶介导的FRT位点的特异性重组分别去除其中的卡那霉素抗性基因，最终基因型分别为E.coli W3110△waaCF△lacIlacZ::FnlpxE，构建成基因工程菌株BW001；构建的lacI敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；构建的FnlpxE‑Fkan插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；构建的waaCF敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述DEAE纤维柱纯化是将用6倍DEAE纤维柱体积的体积比为2:3:1的氯仿/甲醇/水平衡柱子；用一倍体积的体积比为2:3:1的氯仿/甲醇/水溶液洗出Kdo2‑单磷酸类脂A粗样，上样到柱子中；待样品流至填料上端时，用体积比为2:3:1的氯仿/甲醇/醋酸铵溶液进行阶段洗脱，其中水相醋酸铵的浓度梯度分别取60mM、120mM、240mM、360mM、480mM；收集洗脱液并添加适量的氯仿和水，使洗脱液变成Bligh‑Dyer二相体系，静置30mins，取下相，氮吹。