[发明专利]一种人3D结构表皮细胞膜片的制备方法及其临床应用

摘要

本发明公开了一种人3D结构表皮细胞膜片的制备方法及其临床应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）用Wbbase混合酶一次性分离人表皮干细胞、基底层角质细胞和黑色素干细胞等；（2）两步培养法：a)三种细胞无血清混合单层培养；b)细胞的诱导分化及3D结构表皮细胞膜片的培养；（3）细胞膜片的剥离。（4）治疗白癜风、烧伤等皮肤色素脱失性疾病的临床应用。本发明的创造性：（1）同时分离三种细胞，有效时间比传统的胰蛋白酶分离提高150-300倍，不需中和酶的活性，分离的细胞活性大于95%，总收率大于1-5×10⁷/克皮肤；（2）两步培养法同时扩增三种细胞，扩增倍数提升5倍；（3）黑色素形成单位与正常人接近；（4）移植后皮肤复色效果接近或与本人肤色一致。

主权项

一种人3D结构表皮细胞膜片的制备方法及其临床应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）人表皮干细胞、黑色素细胞和基底层角质细胞的共分离将无菌2×2cm²正常全层皮置于盛有20ml WBB无血清培养基的培养皿中，用WBB细胞分离器将皮肤制备成0.1mm×0.1mm²组织颗粒，将组织颗粒置于含Wbbase混合酶的WBB培养基中酶解，4℃酶解10‑12小时，过滤、离心分离，得到三种高活性的种子细胞，包括短暂扩充细胞、毛囊干细胞、滤泡间表皮干细胞（Interfollicle Epidermal Stem Cell，IFESCs）皮脂腺干细胞等，三种细胞活性分别达到95%以上，细胞总收率大于1‑5×10⁷/克皮肤；（2）三种细胞无血清混合单层扩增培养将三种种子细胞接种到培养皿上，细胞密度为1‑2×10⁶个细胞/直径60mm培养皿, 加5mlWBB单层细胞培养基，37℃，5%C0₂培养，每48小时更换一次培养基，4‑7天细胞达到80‑90%的汇合；（3）3D结构表皮细胞膜片的诱导分化共培养当单层培养的细胞达到80‑90%的汇合后，吸出培养皿中的单层细胞培养基，另加入5mlWBB无血清细胞分化培养基，37℃,5%C0₂培养，每48小时更换一次培养基，经7‑10天诱导分化培养，细胞向3D复层结构生长，厚度为3‑10层，形成具有三维结构的表皮细胞膜片；（4）3D结构表皮细胞膜片的剥离方法将带弯针头的微量注射器吸满无菌生理盐水，将弯针头轻轻插入培养皿和细胞膜片间，边插边注射生理盐水，慢慢将3D结构细胞膜片从培养皿底部轻轻剥离，用无菌PBS清洗3遍，置于密封瓶保存备用。