[发明专利]一种高均一性单价链霉亲和素四聚体的制备方法

摘要

本发明公开了一种高均一性单价链霉亲和素四聚体的制备方法，通过分别制备链霉亲和素野生型和活性缺失突变体的重组质粒，进而制备工程菌，基因工程菌发酵表达重组链霉亲和素，将得到的野生型、突变体链霉亲和素包涵体以质量比1：3混合，离心，经包涵体复性并分离得到单价链霉亲和素四聚体，由蛋白酶K或枯草杆菌蛋白酶去除His₈-tag标签。本发明制备方法简单，易操作，得到的单价链霉亲和素四聚体不含对活性有负面影响的His₈-tag标签，并且能够耐受多种因素而保持单价四聚体的状态，具有高均一性和稳定性。

主权项

一种高均一性单价链霉亲和素四聚体的制备方法，其特征在于：1)将链霉亲和素野生型和活性缺失突变体分别克隆到pET28a载体中的NdeI和XhoI酶切位点得到两个重组质粒；2)重组质粒转化到E.coli感受态细胞BL21(DE3)中，细胞培养到OD₆₀₀＝0.7时加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM进行诱导，37℃诱导5小时后收集细胞，‑20℃冻存；3)冻存细胞按缓冲液：菌体重量5ml/g的比例使用破菌缓冲液重悬后在冰浴中进行超声波破碎，离心后取沉淀使用洗涤缓冲液重悬，在16℃搅拌洗涤30min，离心弃掉上清，重复洗涤至包涵体的纯度达到90％以上；4)将尿素溶解的野生型、突变体链霉亲和素包涵体以质量比1：3进行充分混合，并利用快速稀释复性法进行包涵体的复性，复性的样品在4℃条件下搅拌4小时以上，离心弃掉沉淀，上清中加入硫酸氨固体40％饱和度，于4℃下搅拌孵育过夜，离心弃掉沉淀，上清中继续加入硫酸氨固体至70％饱和度，于4℃下搅拌孵育过夜，离心弃上清，得到的沉淀即为盐析作用析出的链霉亲和素四聚体；5)将析出的链霉亲和素四聚体重悬于Ni‑A缓冲液，离心弃掉沉淀，上清使用NTA亲和层析纯化，使用咪唑浓度梯度进行分离；6)NTA亲和层析分离得到的单价链霉亲和素四聚体，按照样品/蛋白酶100：1的质量比与蛋白酶K或者枯草杆菌蛋白酶混合，37℃孵育5小时之后使用排阻层析进行纯化，去除蛋白酶降解的不稳定蛋白以及蛋白酶本身，最后获得高度均一的、无重组标签的、稳定的单价单价链霉亲和素四聚体。