[发明专利]一种同时测定人环孢素作用靶点基因多态性的方法

摘要

本发明提供的一种同时测定人环孢素作用靶点基因多态性的方法，即一种同时测定环孢素作用靶点通路系列蛋白编码基因多个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点基因型的方法，操作简便、无需序列特异性探针，一张芯片可对384个样本进行多重检测，每个体系最多可实现40重反应，同时检测40个SNP位点，通量可根据要求进行个性化调整，高通量，适用范围广，几十到成千上万个样本，同时检测几十到成百上千个位点；无需荧光标记，仅需合成普通引物，单个分析成本低；高灵活度，一张芯片上样本和位点检测匹配可随意选择；分析所需样本量少(10ng)，高灵敏度，检测精度高。 1

主权项

1.一种非诊断和治疗目的的同时测定人环孢素作用靶点基因多态性的方法，其特征在于，包括下列步骤：

步骤1：提取外周血细胞样本的基因组DNA，针对目的基因不同的突变位点设计筛选引物；并组合成不同的PCR反应体系进行多重PCR反应；针对PPIA、PPP3CB、PPP3R1、NFATC1、NFATC2基因中78个SNP位点设计的引物如下表所示：

步骤2：扩增的PCR产物SAP处理后，进行单碱基延伸反应；

步骤3：进行芯片点样后，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行检测；

步骤4：使用软件分析检测结果，获得分型数据；

其中，所述步骤1中使用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并将提取的DNA浓度调整为10‑100ng/ul；所述PCR反应程序为：94℃15min；45个循环：94℃20sec，56℃30sec，72℃1min；72℃3min。

2.根据权利要求1所述的一种同时测定人环孢素作用靶点基因多态性的方法，其特征在于所述SAP反应程序为：37℃40min，85℃5min。

3.根据权利要求1所述的一种同时测定人环孢素作用靶点基因多态性的方法，其特征在于所述单碱基延伸反应条件为：94℃30sec；40个循环：94℃5sec，5个小循环：52℃5sec，80℃5sec；72℃3min。

4.根据权利要求1所述的一种同时测定人环孢素作用靶点基因多态性的方法，其特征在于所述步骤2和步骤3之间还具有产物纯化的步骤，产物纯化的操作为：

(1)取树脂在树脂刮板上均匀覆盖，放置20min；

(2)将步骤2中反应结束的孔板1000rpm离心1min，每孔加入25μL去离子水，倒置在树脂板上面，然后反置将树脂板扣在孔板上，敲击使树脂落入孔板，封膜；

(3)翻转孔板20分钟，3500rpm、离心5min。